配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）

本研究では、ニトロフェンを母体マウスに投与することで横隔膜ヘルニアモデルを作成し、幹細胞投与による治療効果を検討することを目標とした。妊娠8.5日のマウスにニトロフェン25mgを経口投与してモデルマウス作成を試みた。胎仔体重の減少など薬剤の一定の影響は認めたものの、横隔膜ヘルニアの胎仔での発生は全体の10%程度と非常に少ない状況であることが確認された。

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配分額：47450000円 （ 直接経費：36500000円 、 間接経費：10950000円 ）

上記疾患群の中で予後不良である腸管神経節細胞僅少症(HYPO)に、第一にfocusをした。HYPOは腸管神経節細胞は存在するがその数が極めて少ない特徴を有す。同じく腸管神経細胞の減少を認めるマウス(JF1)を用いて、健常児由来の乳歯幹細胞(SHED)を投与した。結果、体重増加を得、その有効性を証明した。次に、HYPO患者由来のSHED(HYPO-SHED)の解析を行った。SHEDは間葉系幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)であるが、HYPO-SHEDは、MSCに矛盾しない表現型を有していること、ならびに増殖能や造腫瘍性に関する解析を行った。

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配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）

代表的腫瘍マーカーであるAFP（Alpha－feto protein）には3つの分画(L1,L2,L3)がある。本研究では免疫学的手法、質量分析法などを用いてL2分画をL3より分離して測定することを可能にし、非侵襲的新規簡易診断システムの開発を行うことを目的とした。
小児固形悪性腫瘍患者、および良性疾患患者の児 (対照群) の血清検体、組織検体を用い、免疫電気泳動法によるL2分画の分離、定量化により得られたデータより新生児期・乳児期における生理的L2分画の基準値設定を行った。

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配分額：4810000円 （ 直接経費：3700000円 、 間接経費：1110000円 ）

医療施設においてX線を用いた検査は必要不可欠なものとなっている。特に胸部単純一般撮影は頻繁に実施される検査であり、それに伴い患者の被ばくが生じる。小児は放射線感受性が成人と比較して高く、検査の際には撮影条件を適切に設定するとともに被ばく線量を評価する必要である。本研究では体系の変化しやすい小児に対して、CTボリュームデータから3Dプリンタ出力可能なポリゴンファントムを開発し、モンテカルロシミュレーションによる臓器吸収線量の評価手法、実物に近い３Dプリントアウトしたファントムの印刷条件を明らかにした。

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配分額：4810000円 （ 直接経費：3700000円 、 間接経費：1110000円 ）

副腎原発神経芽腫において、術前撮影CT画像より、３Dプリンターを用いて立体臓器モデルを作成した。トロッカー挿入可能な樹脂素材を用いて、体躯を作成し、実際の腹腔鏡下右副腎腫瘍摘出術と同様の視野での腫瘍位置のシミュレーションや、トロッカー位置の検討などに使用した。また、神経芽腫の肝転移症例についても、副腎と肝臓の両方のモデルを作成し、手術シミュレーションを行った。
また、神経芽腫と同じ小児悪性腫瘍である肝芽腫において、同様に術前ＣＴ画像から立体臓器モデルを作成。門脈や肝静脈の走行と腫瘍の位置関係を確認するとともに、術前に切離線をシミュレーションし、より解剖が容易に理解できることなど、有用性を認めた。

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配分額：4680000円 （ 直接経費：3600000円 、 間接経費：1080000円 ）

本研究の目的は、肝移植後の学童期から思春期の子どもと親のQOL向上のための看護援助モデルを構築し、課題解決を図ることである。子どもと親を対象にした実態調査、面接調査結果及び文献検討より、子どもと家族のモニタリング指標を作成した。また、調査結果及び文献検討により、生体肝移植後の学童後期から思春期の子どもと親のQOL 向上の概念枠組み、看護援助モデル、パターンごとの看護援助指針を導いた。作成した看護援助モデルは、実践・評価・修正を行い、内容を精錬し肝移植後の学童期から思春期の子どもと親のQOL向上のための看護援助モデルを構築した。

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配分額：5070000円 （ 直接経費：3900000円 、 間接経費：1170000円 ）

子どもを亡くした家族の悲嘆に関するケアニーズを明らかにし、アクションリサーチによって悲嘆に対するサポートプログラムを作成することを目的に研究を実施した。子どもを亡くした家族に個別インタビューを行った結果、子どもの疾患や年齢によって、家族のケアニーズの特徴は異なったものの、共通していたのは【子どものことをなかったことにしたくない】、【子どもの事を知ってほしい】、【ありのままの自分でよいことの保証】、【気持ちを表出できる場がほしい】などであった。
グリーフケアプログラムの試案として、フォーカスグループインタビューを４回、グリーフの集いを1回実施するとともに、グリーフサポートブックを作成した。

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配分額：4940000円 （ 直接経費：3800000円 、 間接経費：1140000円 ）

小児悪性軟部腫瘍は予後不良で、新たな治療標的が望まれる。Forkhead box M1 (FOXM1) は、現在主要な悪性腫瘍におけて新たな治療標的として最も注目されている分子の一つである。
小児悪性軟部腫瘍のうち、横紋筋肉腫（RMS)92例と滑膜肉腫(SS)106例におけるFOXM1発現を評価し、FOXM1発現が予後不良と関連する事を示した。RMSにおいてFOXM1はVEGF発現や血管新生と相関した。SS症例のcDNAマイクロアレイ分析において、細胞周期関連遺伝子の発現がFOXM1発現と相関することを示した。各腫瘍の細胞株に対する研究においてFOM1抑制が新たな治療選択肢となる可能性を示した。

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配分額：44720000円 （ 直接経費：34400000円 、 間接経費：10320000円 ）

小児がんについて、わが国の先端的基礎研究を結集・統合し、次期臨床試験に応用できるトランスレーショナルリサーチを推進することを目的とした。その結果、①血液から抽出できる小児がんの新規バイオマーカーを探索し、治療層別化へ応用可能なマーカーを抽出②低・中間リスク小児がん患者に対する副作用軽減を目指し、間葉系幹細胞を用いたドラッグデリバリーシステムの可能性③高リスク小児がん患者に対するペプチドワクチン、PD-1阻害剤、NKT細胞療法を用いた新規免疫療法の可能性④超高リスク小児がんに対し、次世代ゲノム解析技術を用いた詳細な分子病態を解析・新規分子標的の候補となるゲノム異常、について明らかにした。

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配分額：5330000円 （ 直接経費：4100000円 、 間接経費：1230000円 ）

MYCNトランスジェニックマウスのホモ・ヘテロについて、Hedgehogシグナル関連タンパク（Sonic Hh, GLi1, Patched）の蛋白発現の検討を行った。HE染色ではホモ・ヘテロともにヒト神経芽腫のundiffrentiated subtype相当と病理組織学的に差がなかった。また、Sonic Hh, patchedの発現は陽性であったがGlI1についてはホモ・ヘテロとも陰性であった。我々が報告しているヒト神経芽腫検体においては、GLI1も陽性であった結果と異なっており、MYCNトランスジェニックマウスにおいてヒトとHhシグナル活性化が異なることが明らかとなった。

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配分額：5590000円 （ 直接経費：4300000円 、 間接経費：1290000円 ）

NICUにおける高照度・騒音の治療環境の基準や、developmental careへの示唆を得る目的で、睡眠・覚醒リズムや睡眠の質評価、生理的反応の日内変動の特徴などを明らかにした。子宮内模擬暗環境の介入観測も行い、暗環境（＜50Lux）で活動量低下の傾向を認めたが、睡眠の質に有意差はなく、70-80ｄＢ以上の騒音には啼泣を認め、照度よりも騒音への刺激が覚醒に繋がっていることが示唆された。

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配分額：4420000円 （ 直接経費：3400000円 、 間接経費：1020000円 ）

我が国における子どもホスピスの可能性を探るために、当事者の視点から体験を明らかにし、医療者のみならず、一般の人や多領域の専門職と協働し、アクションリサーチを行った。難病の子どもと家族のケアニーズとして、幼児期、高校卒業後のQOLが低く、発達へのケアニーズが高かった。また3組の子どものend of life careに関わり、医療ケアのみならず、子どもの成長と家族の発達支援に関するニーズが明らかとなった。また教育啓発活動や難病の子どもと家族のQOLを支援するためのプログラムを実施するとともに、多職種とともに子どもホスピスネットワークを構築した。これらの活動を通して、日本型小児ホスピスを検討した。

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配分額：4420000円 （ 直接経費：3400000円 、 間接経費：1020000円 ）

【目的】小児固形悪性腫瘍におけるGlypican3の新規腫瘍マーカーとしての有用性の検討と、特異的発現を示す小児固形悪性腫瘍に対しては診断システムの構築を行い、さらにGlypican3を標的とした免疫遺伝子治療を開発することを最終目的とする。【方法】当科で経験した小児固形悪性腫瘍の病理検体、および患者血清に対してGlypican3とAFPの免疫組織学検討とELISAによる血清値測定を行った。【結果】肝芽腫、悪性胚細胞腫のほぼ全例、約1/3のウィルムス腫瘍の患者、胞巣型横紋筋肉腫、未分化肉腫の患者の組織と血清にはGlypican3の発現が認められた。AFPに関しては肝芽腫、悪性胚細胞腫のほぼ全例に発現が認められた。また非担癌患者においては出生直後の年齢層において血清Glypican3は高値であり、1歳前後にかけて徐々に減衰傾向が認められ1歳以降においてはほぼ正常化することが確認され、生理的減衰傾向を示す胎児性腫瘍マーカーであることが示唆された。【考察】Glypican3は小児固形悪性腫瘍における新規腫瘍マーカーとして有用であることが示された。この基礎研究の結果を元に1歳以降でGlypican3が発現している難治性の腫瘍に対してはがんワクチン療法をはじめとする免疫療法や関連遺伝子を対象とした分子標的治療の実現の可能性が期待される。

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配分額：17290000円 （ 直接経費：13300000円 、 間接経費：3990000円 ）

ニトロフェン誘導の横隔膜ヘルニアラットに肺組織内間葉系幹細胞(MSC)を投与した。その結果、肺のPCNA陽性細胞が増加。臨床例20例のDNAの抽出を行いSNP-arrayを施行。その結果TCTE3のmicrodeletionを検出。再発例に腹壁筋フラップ法を11例に施行し良好な結果。脱落乳歯の歯髄細胞(SHED)から肝細胞の分化に成功。SHEDの多分化能を利用して横隔膜筋細胞のシート作成を開始。

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配分額：4550000円 （ 直接経費：3500000円 、 間接経費：1050000円 ）

先天性横隔膜ヘルニアの新たな胎児治療戦略として、細胞外マトリックス代謝からの戦略を行うための基礎実験を行った。低形成肺のモデルとして、通常使用されるNitrofen-inducedモデルや新たなモデルとしてGja-1 knock-outモデルを使用し、その発達の程度を検討した。またコラーゲンなどの細胞外マトリックスやその分解酵素について、分布やタンパク発現量を検討した。どちらの低形成肺でも、発達がきわめて遅れており、組織培養を行い、成長因子などの投与によりこの発達の遅れが改善する可能性が示唆された。

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配分額：4420000円 （ 直接経費：3400000円 、 間接経費：1020000円 ）

Glypican3(GPC3)は膜結合型Glypicanファミリー6種類のうちの一つで1997年にHsuらがHCC組織においてGPC3の発現が有意に高いことが報告した。以後、卵巣癌、悪性中皮腫、乳癌、大腸癌などにおいても発現があることが報告された。小児固形悪性腫瘍に関してはいくつかの報告が散発的にあるが、その腫瘍マーカーとしての有用性までには言及されていない。今回我々はウイルムス腫瘍をはじめとする小児固形悪性腫瘍全般におけるGPC3の発現を検討し、新規腫瘍マーカーとしての有用性を検討した。方法は血清中のGPC3(sGPC3)、AFP(sAFP)、組織は免疫組織によりGPC3(tGPC3)、AFP(tAFP)について検討した。34例中3例がsGPC3(+) /sAFP(+)(肝芽腫2例、卵黄嚢癌1例)であった。一方4 例がsGPC3(+)/sAFP(-)であった(未分化肉腫1例、神経芽腫1例、Wilms腫瘍1例、 Solid Pseudopapillary Tumor1例)。このうち、未分化肉腫の症例においてはsGCP3が治療効果に伴い、経時的に減少傾向を示した。これらの所見よりGPC3はAFPに類似した動態を示す癌胎児性蛋白であるが、GPCを特異的に発現する小児腫瘍が存在することが示され、sGPC3(+) かつsAFP(-)を呈する腫瘍においては新規腫瘍マーカーとなる可能性が示唆された。

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配分額：4040000円 （ 直接経費：3500000円 、 間接経費：540000円 ）

神経芽腫に対する外科療法と併用した樹状細胞治療の開発を目的に、前臨床試験としてマウス皮下担癌モデルにおいて、センダイウイルスベクター導入樹状細胞(SeV/DC)は有意に腫瘍増殖を抑制し、さらにSeVに搭載する遺伝子としてIFN-βを用いること、また放射線療法の併用療法で抗腫瘍効果が増強することを確認した。さらに、新たな知見として、放射線前照射によりSeV/DCが誘導する抗腫瘍免疫は、CTL活性を増強し長期メモリーを成立させることが分かった。また、抗腫瘍効果を担う主な免疫細胞は、原発巣の縮小にはCD4陽性T細胞が、再移植時にはCD8陽性T細胞が重要であることが示唆された。現在、臨床研究のプロトコールを作成中である。

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配分額：3500000円 （ 直接経費：3500000円 ）

神経芽腫の臨床検体を用い、favorable群として、1歳未満、マス陽性、stage1、MYCN増幅なし、aneuploid、嶋田favorable histologyの3検体、unfavorable群として、1歳以上、マス陰性、stage4、MYCN増幅あり、diploid、嶋田unfavorable histologyのもの3検体からのRNAをそれぞれ、poolし、2群間の比較としてマイクロアレイにて解析をおこなった。マイクロアレイの結果より、favorableに発現が優位の遺伝子の中から、神経芽腫に特異的と思われるものを選択し、約60の臨床検体について、real-time PCRにて発現の解析をおこなった。
マイクロアレイの結果より、unfavorable群に発現が優位な遺伝子は約400、favorable群に優位なものは約40あり、favorable群の中から、unfavorableの約3倍の発現が認められた胎生期の神経細組織に特異的に発現しているneuronatinという遺伝子に着目した。他の予後因子および臨床像とneuronatinの発現との関連について解析すると、予後不良因子を有する群ではいずれも低発現の傾向であり、嶋田分類favorable/unfavorable、MYCN増幅/非増幅、生存例/死亡例での発現の比較にて有意差が認められた。neuronatinとtrkAの発現の相関は認められなかった。
また、neuronatin低発現であるMYCN増幅の神経芽腫細胞株に脱メチル化剤を作用させたところ、neuronatinの発現の増加が認められた。これより、neuronatinは予後不良の神経芽腫においてメチル化により発現が抑制されていると考えられた。また、同じ細胞株neuronatinを強制発現させると、細胞の分化傾向が認められた。
neuronatinは、その機能はまだ不明の点が多いが、神経系の発生に関与することが推測されている遺伝子である。研究結果より、neuronatinの神経芽腫の分化への関与が示唆された。

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配分額：14500000円 （ 直接経費：14500000円 ）

新生児外科疾患は、周産期・周術期管理、手術手技・薬物療法の発展や医療機器の発達によりその予後が大きく改善した。しかし、先天性横隔膜ヘルニア(CDH)は、いまだに高い死亡率を示す予後不良な疾患である。CDHの予後を決定する因子は肺の低形成と新生児遷延性肺高血圧(以下PPHN)である。特に肺低形成に起因する絶対換気量の不足は決定的な予後不良因子となる。
肺低形成の治療は、胎児の気管閉塞術にて肺の発育を促す試みが行われているが、結果は出生後治療と差がなく、むしろ早産率を増加させた。従って現状では肺の発達を促す薬物治療が、実際的で応用範囲が広いと考えられる。
肺発生過程には、FGFやIGFといった種々の増殖因子の関与が判明している。我々はマウスの胎齢11日目から18日目までの肺を摘出し,RT-PCR法を用いて各時期の胎児肺におけるIGF-1,IGF-2,IGF-1R,IGF-2Rの発現について定量化を行った。その後,胎齢17日目に摘出した胎児肺に対して48時間の組織培養を行い,IGF-1,IGF-2投与群と非投与群について,抗BrdU染色,TTF-1,SP-Cを用いた免疫染色による比較検討を行った。
その結果,IGF-1Rは管状期から嚢状期にm-RNAの発現の強い上昇を認めた。また,組織培養後の抗BrdU抗体染色では,IGF-1,IGF-2投与群は,非投与群と比較して間質細胞の細胞数において有意な増加を認めた。また,TTF-1,SP-C免疫染色においても,IGF-1,IGF-2投与群において、陽性細胞の増加をみた。
IGF-1Rは、肺発生過程の管状期から嚢状期に強く発現し,成獣になると発現は低下する。肺発生の上皮間質相互作用においてIGF-1,IGF-2は,IGF-1Rを介して間質細胞に働きかけ,肺胞上皮の成熟を促進する可能性が示唆された。この結果,胎児期の母体へのIGF投与は,低形成肺の成熟を促進できる可能性が示唆された。

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配分額：3400000円 （ 直接経費：3400000円 ）

β-カテニンのoncogenesisへの関与は小児悪性腫瘍においては近年、肝芽腫の発生に強く関与する報告がなされている。肝芽種の約50%の症例においてβ-カテニンの変異が検出されており、その発生への関与が示唆されている。しかし他の小児固形悪性腫瘍へのβ-カテニンの関与は今のところ不明である。ウイルムス腫瘍の発生にはWT1遺伝子異常が関与するとされてきたが、その頻度は10%程度であり、oncogenesisにどのように関わっているかの詳細は未だ不明である。近年、β-カテニンもウイルムス腫瘍に15%程度の頻度で異常を認めるとされており、本研究ではβ-カテニン遺伝子とWT1遺伝子のウイルムス腫瘍の発生ならびに発育における関与を明らかにすることを目的とした。1964年より2005年の間に九州大学小児外科教室において経験されたウィルムス腫瘍40例を対象とし、免疫組織学的にβ-カテニン、WT1遺伝子の発現を検討した。β-カテニンについては細胞膜に陽性を示したものが38例(100.0%)、細胞質に陽性を示したものが35例(92.1%)、核内移行を示したものが9例(23.7%)であった。組織型別での陽性率は腎芽型成分に35例(92.1%)、上皮型細胞成分に12例(31.6%)、問葉型成分には2例(5.3%)の陽性率であった。WT1については細胞質に陽性を示したものが30例(79.0%)、核内移行を示したものが22例(57.9%)であり、組織型別での陽性率は、腎芽型細胞成分に21例(55.2%)、上皮型細胞成分に14例(36.8%)、間葉成分には3例(7.9%)の陽性率であった。β-カテニンにて核内移行を示した9例は全例WT1にても核内移行を示した。さらに組織内におけるDNAの発現と変異を調べるためにMicrodissectionにてこれらのパラフィン標本より組織型別にDNAを抽出し、検出されたDNAをSequencerを用いてdirect sequenceを行った。しかしqualityの高いDNAを得ることができず、有意な結果を得ることはできなかった。以上よりウィルムス腫瘍におけるβ-カテニン、WT1遺伝子のoncogenesisへの関与に関しては免疫組織学的検討により同時に核内移行を示す約20%の症例において何らかの関与があることが示唆された。

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配分額：3400000円 （ 直接経費：3400000円 ）

乳児神経芽腫マススクリーニングによる発見症例は、その生存率は98%と非常に高く、一見その目的は達成されているようにみえるが、マス検査陰性後に臨床的に発見される症例(マス陰性例)が数多く存在し、それらは進行症例が多く、予後不良である(J Pesiatr Surg.1998:33,1674-1678)。日本以外で全国規模でマスを施行している国は世界になく、多数のマス発見例及びマス陰性例の詳細な生物学的特性の解析と臨床経過の検討は、マスの有効性の評価及びマス症例の治療方針の決定に直結するだけでなく、神経芽腫全体の生物学的多様性を究明するデータとなることが予想される。
現在までの研究で、神経芽腫の遺伝子異常を高感度かつ迅速に解析を行う手法としてMYCN amp.と1p del.に関してflourescence in situ hybridization(FISH)による解析を確立し(J Pediatr Surg,1999:34,1615-1619)、また、MYCN amp.と17q gainに関してReal Time PCR(TaqMan^<TM>PCR)による解析を確立した(Cancer Lett.2001:10,89-94)。
MYCN amp.に関しては、今年度の研究によりFISHとReal Time PCRによる組み合わせが最も正確にamplificationの状態を評価することができて、神経芽腫の悪性度と非常に相関している結果を得て発表した(J Pediatr Surg.2004:39,63-68)。
さらに、定量的PCRによりMYCN amp.,17 q gain,1p del.,11p del.,14q del.の同時解析を行った結果、MUCN amp.,17q gain,1p delの高感度解析の組み合わせにより、乳児神経芽腫の生物学的悪性度の層別化が可能であり、マス休止後の臨床的に発見される乳児神経芽腫の治療方針に決定に有意義であると考えられた。

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