Language：English   Publishing type：Research paper (scientific journal)  

OBJECTIVE: The human adrenal cortex comprises three functionally and structurally distinct layers that produce layer-specific steroid hormones. With aging, the human adrenal cortex undergoes functional and structural alteration or "adrenal aging", leading to the unbalanced production of steroid hormones. Given the marked species differences in adrenal biology, the underlying mechanisms of human adrenal aging have not been sufficiently studied. This study was designed to elucidate the mechanisms linking the functional and structural alterations of the human adrenal cortex. METHODS: We conducted single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics analysis of the aged human adrenal cortex. RESULTS: The data of this study suggest that the layer-specific alterations of multiple signaling pathways underlie the abnormal layered structure and layer-specific changes in steroidogenic cells. We also highlighted that macrophages mediate age-related adrenocortical cell inflammation and senescence. CONCLUSIONS: This study is the first detailed analysis of the aged human adrenal cortex at single-cell resolution and helps to elucidate the mechanism of human adrenal aging, thereby leading to a better understanding of the pathophysiology of age-related disorders associated with adrenal aging.

DOI： 10.1016/j.molmet.2024.101954

PubMed

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Language：English   Publishing type：Research paper (scientific journal)  

The accuracy of the structural annotation of unidentified peaks obtained in metabolomic analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC/MS/MS) can be enhanced using retention time (RT) information as well as precursor and product ions. Unified-hydrophilic-interaction/anion-exchange liquid chromatography high-resolution tandem mass spectrometry (unified-HILIC/AEX/HRMS/MS) has been recently developed as an innovative method ideal for nontargeted polar metabolomics. However, the RT prediction for unified-HILIC/AEX has not been developed because of the complex separation mechanism characterized by the continuous transition of the separation modes from HILIC to AEX. In this study, we propose an RT prediction model of unified-HILIC/AEX/HRMS/MS, which enables the comprehensive structural annotation of polar metabolites. With training data for 203 polar metabolites, we ranked the feature importance using a random forest among 12,420 molecular descriptors (MDs) and constructed an RT prediction model with 26 selected MDs. The accuracy of the RT model was evaluated using test data for 51 polar metabolites, and 86.3% of the ΔRTs (difference between measured and predicted RTs) were within ±1.50 min, with a mean absolute error of 0.80 min, indicating high RT prediction accuracy. Nontargeted metabolomic data from the NIST SRM 1950–Metabolites in frozen human plasma were analyzed using the developed RT model and in silico MS/MS prediction, resulting in a successful structural estimation of 216 polar metabolites, in addition to the 62 identified based on standards. The proposed model can help accelerate the structural annotation of unknown hydrophilic metabolites, which is a key issue in metabolomic research.

DOI： 10.1021/acs.analchem.3c04618

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Language：Japanese   Publisher：(一社)日本内分泌学会  

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Authorship：Lead author   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Publisher：Elsevier BV  

DOI： 10.1016/j.jlr.2023.100492

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Language：English   Publishing type：Research paper (scientific journal)  

BACKGROUND: Diabetes is associated with an increased risk of deleterious changes in muscle mass and function or sarcopenia, leading to physical inactivity and worsening glycaemic control. Given the negative energy balance during sodium-glucose cotransporter-2 (SGLT2) inhibition, whether SGLT2 inhibitors affect skeletal muscle mass and function is a matter of concern. However, how SGLT2 inhibition affects the skeletal muscle function in patients with diabetes remains insufficiently explored. We aimed to explore the effects of canagliflozin (CANA), an SGLT2 inhibitor, on skeletal muscles in genetically diabetic db/db mice focusing on the differential responses of oxidative and glycolytic muscles. METHODS: Db/db mice were treated with CANA for 4 weeks. We measured running distance and handgrip strength to assess skeletal muscle function during CANA treatment. At the end of the experiment, we performed a targeted metabolome analysis of the skeletal muscles. RESULTS: CANA treatment improved the reduced endurance capacity, as revealed by running distance in db/db mice (414.9 ± 52.8 vs. 88.7 ± 22.7 m, P < 0.05). Targeted metabolome analysis revealed that 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-D-ribofuranosyl 5'-monophosphate (AICARP), a naturally occurring AMP-activated protein kinase (AMPK) activator, increased in the oxidative soleus muscle (P < 0.05), but not in the glycolytic extensor digitorum longus muscle (P = 0.4376), with increased levels of AMPK phosphorylation (P < 0.01). CONCLUSIONS: This study highlights the potential role of the AICARP/AMPK pathway in oxidative rather than glycolytic skeletal muscles during SGLT2 inhibition, providing novel insights into the mechanism by which SGLT2 inhibitors improve endurance capacity in patients with type 2 diabetes.

DOI： 10.1002/jcsm.13350

PubMed

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Publishing type：Research paper (scientific journal)   Publisher：Springer Science and Business Media LLC  

Abstract

4-hydroxytamoxifen (OHT) is an anti-cancer drug that induces apoptosis in breast cancer cells. Although changes in lipid levels and mitochondrial respiration have been observed in OHT-treated cells, the overall mechanisms underlying these metabolic alterations are poorly understood. In this study, time-series metabolomics and lipidomics were used to analyze the changes in metabolic profiles induced by OHT treatment in the MCF-7 human breast cancer cell line. Lipidomic and metabolomic analyses revealed increases in ceramide, diacylglycerol and triacylglycerol, and decreases in citrate, respectively. Gene expression analyses revealed increased expression of ATP-dependent citrate lyase (ACLY) and subsequent fatty acid biosynthetic enzymes, suggesting that OHT-treated MCF-7 cells activate citrate-to-lipid metabolism. The significance of the observed metabolic changes was evaluated by co-treating MCF-7 cells with OHT and ACLY or a diacylglycerol O-acyltransferase 1 (DGAT1) inhibitor. Co-treatment ameliorated cell death and reduced mitochondrial membrane potential compared to that in OHT treatment alone. The inhibition of cell death by co-treatment with an ACLY inhibitor has been observed in other breast cancer cell lines. These results suggest that citrate-to-lipid metabolism is critical for OHT-induced cell death in breast cancer cell lines.

DOI： 10.1038/s41598-023-45764-2

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Other Link： https://www.nature.com/articles/s41598-023-45764-2

Language：Japanese   Publisher：(一社)日本内分泌学会  

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Language：Japanese   Publisher：(一社)日本内分泌学会  

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Language：Japanese   Publisher：日本筋学会・筋ジストロフィー医療研究会  

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Authorship：Lead author   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Publisher：Elsevier BV  

DOI： 10.1016/j.ebiom.2023.104733

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Language：Japanese   Publisher：(一社)日本内分泌学会  

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Publishing type：Research paper (scientific journal)  

DOI： 10.1016/j.aca.2023.340863

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Language：English   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Publisher：The Mass Spectrometry Society of Japan  

DOI： 10.5702/massspectrometry.a0112

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Authorship：Lead author   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Publisher：American Chemical Society (ACS)  

DOI： 10.1021/acs.analchem.2c03986

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Language：English   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Publisher：Elsevier {BV}  

DOI： 10.1016/j.isci.2022.105612

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Authorship：Lead author   Language：English   Publishing type：Research paper (scientific journal)   Publisher：The Mass Spectrometry Society of Japan  

DOI： 10.5702/massspectrometry.a0080

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Language：Japanese  

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Language：Japanese   Publisher：J. Mass. Spectrom. Soc. Jpn.  

DOI： 10.5702/massspec.S20-09

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Language：Japanese  

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Event date： 2023.11

Language：Japanese  

Venue：パシフィコ横浜ノース（神奈川県横浜市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.11

Language：Japanese  

Venue：パシフィコ横浜ノース（神奈川県横浜市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.11

Language：Japanese  

Venue：パシフィコ横浜ノース（神奈川県横浜市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.10

Language：English  

Venue：京都   Country：Japan  

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Event date： 2023.9

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.9

Language：English  

Venue：グランシップ（静岡県コンベンションアーツセンター）（静岡県静岡市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.9

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.9

Language：English  

Venue：グランシップ（静岡県コンベンションアーツセンター）（静岡県静岡市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.9

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.9

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.8

Language：Japanese  

Country：Korea, Republic of  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：朱鷺メッセ新潟コンベンションセンター（新潟県新潟市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：朱鷺メッセ新潟コンベンションセンター（新潟県新潟市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.7

Language：Japanese  

Venue：ホテル&リゾーツ別府湾（大分県速見郡）   Country：Japan  

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Event date： 2023.6

Language：English  

Venue：McCormick Place - West Building (Chicago, Illinois, USA)   Country：United States  

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Event date： 2023.6

Language：English  

Venue：George R. Brown (GRB) Convention Center (Houston, Texas, USA)   Country：United States  

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Event date： 2023.6

Language：Japanese  

Venue：名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.6

Language：Japanese  

Venue：パシフィコ横浜 会議センター（神奈川県横浜市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.6

Language：English  

Venue：George R. Brown (GRB) Convention Center (Houston, Texas, USA)   Country：United States  

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Event date： 2023.6

Language：English  

Country：United States  

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Event date： 2023.6

Language：English  

Venue：McCormick Place - West Building (Chicago, Illinois, USA)   Country：United States  

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Event date： 2023.6

Language：Japanese  

Venue：パシフィコ横浜 会議センター（神奈川県横浜市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.6

Language：Japanese  

Venue：名古屋国際会議場（愛知県名古屋市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.5

Language：Japanese  

Venue：大阪   Country：Japan  

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Event date： 2023.5

Language：Japanese  

Venue：グランキューブ大阪（大阪国際会議場）（大阪府大阪市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.5

Language：Japanese  

Venue：グランキューブ大阪（大阪国際会議場）（大阪府大阪市）   Country：Japan  

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Event date： 2023.5

Language：Japanese  

Venue：大阪   Country：Japan  

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Event date： 2022.12

Language：Japanese  

Venue：福岡県福岡市   Country：Japan  

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Event date： 2022.10

Language：Japanese  

Country：Japan  

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Event date： 2022.10

Language：Japanese  

Venue：大阪府豊中市（ハイブリッド開催）   Country：Japan  

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Event date： 2022.10

Language：Japanese  

Venue：大阪府豊中市（ハイブリッド開催）   Country：Japan  

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Event date： 2022.10

Language：Japanese  

Venue：佐賀県佐賀市   Country：Japan  

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Event date： 2022.9

Language：Japanese  

Venue：山形県鶴岡市   Country：Japan  

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Event date： 2022.9

Language：Japanese  

Venue：山形県鶴岡市   Country：Japan  

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Event date： 2022.8 - 2022.9

Language：Japanese  

Country：Japan  

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Event date： 2022.6

Language：Japanese  

Venue：福岡県福岡市   Country：Japan  

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Event date： 2022.6

Language：Japanese  

Venue：福岡県福岡市   Country：Japan  

血中代謝物の網羅的測定は疾患の早期発見やリスク評価に利用できるものと期待されているが，臨床診断法として社会実装された事例は新生児マススクリーニングやアミノインデックス検査などわずかである．その理由の一つとして，これまで多くの研究で測定対象であった親水性の一次代謝物は，様々な環境因子によって変化するために疾患特異性が低いのかもしれない．一方，ステロイドホルモンや胆汁酸，エイコサノイドなどの生理活性脂質は，分子量は300-600程度でlogPowは0-7程度の範囲にある分子群であり，生体内ではシグナル伝達物質としての役割を担っている．したがって，血中の生理活性脂質の包括的かつ定量的な情報は，健康状態を把握するのに有益な指標となる可能性がある．しかしながら，これら生理活性脂質の測定法については，これまで限定的にはいくつか報告があるものの，一斉定量分析法は未だ開発されていない．そこで本研究では，生理活性脂質の包括的一斉定量分析法を構築するために，前処理法からLC/MS/MS分析法に至る詳細な検討を実施したので報告する．
はじめに，三連四重極質量分析を用いて176種の標準品と52種の安定同位体標識内部標準物質について，フローインジェクション分析により選択反応モニタリングの分析条件を最適化した．次に，分離カラム4種と移動相2種を用いてLC分離条件を検討した．ピーク形状，カバレージ，分析安定性の観点からLC分離条件を評価すると，カラムはInertsil® ODS-4 (3.0 µm, 2.1 mm i.d. 150 mm)，移動相はA：水/アセトニトリル (75/25)，B：イソプロパノールにそれぞれ5 mMの酢酸アンモニウムを添加した溶媒でのグラジエント溶離法が最も良い条件であった．LC/MS/MS条件を最適化することにより，150種以上の生理活性脂質の定量分析が可能となった．次に，前処理法として固相抽出法を検討した．固相抽出では固相へのサンプルアプライ後の洗浄溶媒を7通りで比較した．測定対象成分の回収率を検討したところ，0.1%ギ酸水⇒15%エタノール/0.1%ギ酸水⇒ヘキサンにより固相を洗浄する方法が測定対象成分の回収率の最も良い方法であり，測定対象成分の大部分において回収率70%以上を達成できていた．次に，測定対象成分の溶出画分をLC/MSのスキャンモードで測定し夾雑成分が除去できているかどうか確認したところ，分子量200以下の低分子夾雑成分と分子量800以上の中分子夾雑成分が除去できていることが確認できた．さらにタンパク質成分の除去効率も99.6%であり良好であった．最後に，最適化した前処理法とLC/MS/MS法を用いて，健常者および疾患者の血漿の生理活性脂質の測定を行ったところ，70種以上の生理活性脂質の測定に成功し，200回以上の連続分析でも質量分析の感度を低下させることはなかった．健常者の測定結果では，性差や概日リズムを反映したプロファイルを観測することができ，既報以外にも性差や概日リズムを呈する生理活性脂質が存在することが示唆された．以上により，固相抽出法とLC/MS/MS法を組み合わせた本分析システムは，多検体の包括的な生理活性脂質の一斉定量解析に有用であることが示された．

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Event date： 2022.6

Language：Japanese  

Venue：福岡県福岡市   Country：Japan  

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Event date： 2022.6

Language：Japanese  

Venue：福岡県福岡市   Country：Japan  

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Event date： 2022.1

Language：English  

Venue：オンライン   Country：Japan  

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Event date： 2021.11

Language：Japanese  

Venue：オンライン   Country：Japan  

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Event date： 2021.11

Language：English  

Venue：オンライン   Country：Japan  

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Event date： 2021.11

Language：Japanese  

Venue：オンライン   Country：Japan  

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Event date： 2021.10

Language：Japanese  

Venue：オンライン   Country：Japan  

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Event date： 2021.7

Language：Japanese  

Venue：オンライン   Country：Japan  

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Event date： 2021.5

Language：Japanese  

Venue：オンライン   Country：Japan  

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Event date： 2020.5 - 2020.6

Language：English  

Venue：オンライン   Country：United States  

Introduction (Limit 120 words)
The rapid development of next-generation sequencing techniques has enabled single-cell genomic and transcriptomic analyses, which have revealed the importance of heterogeneity in biological systems. However, analytical methods to accurately identify and quantify comprehensive metabolites from single mammalian cells with a typical diameter of 10–20 m are still in the process of development. Here, we developed single-cell metabolomic analytical system based on a live single-cell sampling method and highly sensitive nano-liquid chromatography tandem mass spectrometry (nano-LC/MS/MS) with multiple reaction monitoring.
(80 words)


Method (Limit 120 wards)
Tapered nanosprayer tips were fabricated using a fused-silica capillary (100 m i.d.) and a CO2-laser-based capillary puller (P-2000, Sutter Instrument Co., Novato, CA, USA). A Nanobaume SP-400 column packer system (Western Fluids Engineering, Wildomar, CA, USA) with 3-m Discovery HSF5 particles (Merck, Darmstadt, Germany) connected to a double-plunger micro pump (KP-22-01A, FLOM Inc., Tokyo, Japan) was employed to fabricate nano-LC columns. Nano-LC/MS/MS analyses were conducted using a Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano system (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) coupled to a LCMS-8060 (Shimadzu Co., Kyoto, Japan) equipped with a nano-LC interface (AMR Inc., Tokyo, Japan). A single-cell sampling method was developed based on limiting dilution method using gas-tight syringe-based nanopipette device and a fused-silica capillary (100 m i.d.).
(120 words)


Preliminary data (Limit 300 words)
We first fabricated nano-LC columns integrated with nanosprayers by packing the PFPP particles (3-m particle size) into 0.1-mm i.d. fused-silica capillary tubes with a tapered nanosprayer tip. After optimizing the analytical conditions, the developed PFPP-nano-LC/MS/MS method provided peak areas with good repeatability (relative standard deviations, RSDs, < 16%; and averaged RSDs, 7.2%) and showed a linear correlation coefficient (R2) between 0.9800 and 1.0000 for all of the targeted metabolites. In the PFPP-nano-LC/MS/MS system, the LOD for 10 hydrophilic metabolites (phenylalanine, valine, UMP, proline, histidine, tryptophan, GMP, CMP, leucine, and glutamic acid) were in the sub-fmol range, i.e., in the range of 20–950 amol.
To apply the highly sensitive PFPP-nano-LC/MS/MS method to single-cell metabolomics, we developed a living single-cell sampling system with a nanopipette device. Using the system, single-HeLa cells were isolated into fused-silica capillary based on limiting dilution method, and injected into PFPP-nano-LC/MS/MS system based on valve-switching. By combining live single-cell sampling and nano-LC/MS/MS, we were able to successfully identify 18 relatively abundant hydrophilic metabolites (16 amino acids and 2 nucleic acid related metabolites) from single HeLa cells (n = 22). Based on these single-cell metabolic profiles, it was possible to classify the 22 HeLa cells into three distinct subclasses, suggesting differences in metabolic function existed in the cultured HeLa cell population.
To our knowledge, this represents the first report to describe metabolic heterogeneity at the single-cell level in a dish-cultured HeLa cell population. The analytical system developed in this study is a new tool for single-cell metabolomic analysis and thus will facilitate future research in tumor heterogeneity.
(259 words)

Novel aspect (20 words)
Highly sensitive nano-LC/MS/MS with single-cell sample preparation method identified 18 hydrophilic metabolites in typical mammalian cells (diameter 10–20 m)
(20 words)

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Event date： 2020.5

Language：Japanese  

Venue：みなし開催   Country：Japan  

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Event date： 2020.5

Language：Japanese  

Venue：みなし開催   Country：Japan  

近年の次世代シーケンサー技術の急速な発展により，シングルセルレベルでのゲノム，トランスクリプトーム解析が可能となった．その結果，特定の細胞が持つ表現型が生命システムにおいて重要な役割を果たすことが明らかになってきた．しかしながら，ゲノム，トランスクリプトームの1細胞計測が可能となった一方で，メタボロームの1細胞計測技術は未だ発展途上の段階である．特に，細胞サイズの小さな典型的な動物細胞 (細胞直径10-20 m) の1細胞メタボローム計測は未だ達成できていない．本研究では，培養HeLa細胞 (細胞直径10-20 m) を用いて，ナノ液体クロマトグラフィー三連四重極型質量分析 (nano-LC/MS/MS) を基盤とした代謝物の高感度計測技術および単一細胞試料調製・導入技術を組み合わせた1細胞メタボローム分析システムを開発することを目的とした．
Nano-LC/MSでは，①カラム内径のダウンサイジングに伴ってカラム内で物質濃度が上昇し，②エレクトロスプレーイオン化 (ESI) 部でのスプレー微細化によってイオン化効率が向上し，③ESIニードルをオリフィスへ接近させることによってイオン導入効率が向上することにより高感度化が達成される．はじめに，代謝物の保持が比較的良好なpentafluorophenylpropyl (PFPP) 粒子を内径100 mのフューズドシリカキャピラリーチップに充填し，親水性代謝物計測用nano-LCカラムを作製した．次に，細胞内で比較的豊富なアミノ酸，核酸塩基，ヌクレオシド，ヌクレオチドの合計35種類の化合物を測定対象として，PFPP-nano-LCおよび三連四重極型質量分析による選択反応モニタリング (SRM) の各種条件の最適化を行った．カラム内径が2.1 mmの汎用LC/MS/MS法と比較すると，開発したPFPP-nano-LC/MSでは最大で132倍，平均26倍の感度向上が確認された．また，当該手法は10種の代謝物について，アトモル範囲の検出限界 (20−950 amol) を達成した．次に，限界希釈法に基づく単一HeLa細胞の単離方法とバルブ切り替えに基づくnano-LC/MS/MSへの注入法を考案し，これらを組み合わせて培養HeLa細胞の1細胞メタボローム分析を実施した (n = 22)．その結果，単一HeLa細胞から合計18種の代謝物を同定・計測することに成功した．培養HeLa細胞における代謝物のばらつきを解析したところ，個々の細胞の代謝のヘテロ性が確認された．代謝物によってばらつきは異なっていたが，例えば，ばらつきの大きかったチロシンでは平均値から最大で5.2倍，最小で0.15倍の存在量を示す細胞を確認することができた．最後に，このようにばらつきを持つ細胞の中に類似した代謝パターンを示す細胞が存在するかを調べるために，階層的クラスター解析を行った．その結果，培養HeLa細胞にも類似した代謝状態を示すサブクラスが存在することが示唆された．以上の結果から，本手法はシングルセルメタボロミクス研究を推進するための有効な解析システムであるといえる．

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Event date： 2020.5

Language：Japanese  

Venue：みなし開催   Country：Japan  

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Event date： 2019.12

Language：Japanese  

Venue：京都   Country：Japan  

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Event date： 2019.10

Language：Japanese  

Country：Japan  

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Event date： 2019.9

Language：Japanese  

Venue：岡山   Country：Japan  

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Event date： 2019.7

Language：Japanese  

Venue：宮崎   Country：Japan  

解糖系，クエン酸回路，アミノ酸代謝，核酸代謝など，生命活動を担う主幹代謝経路の中間代謝物は，高極性のイオン性 (親水性) 代謝物である．これらの代謝物を精確にプロファイルすることは，生命システムの理解に大きく貢献しうる．これまで親水性代謝物の測定は，主にキャピラリー電気泳動質量分析 (CE-MS)，イオンペア逆相液体クロマトグラフィー質量分析 (ion-pair RPLC/MS)，親水性相互作用液体クロマトグラフィー質量分析 (HILIC/MS) によって測定されてきた．しかし，親水性代謝物は極性，電荷特性，分子量といった物性の範囲が幅広いため，単一手法での包括的測定には至っておらず，第一選択となる分析法の開発は未だ発展途上の段階である．本研究では，1̴3級アミンおよび4級アンモニウム基を修飾したメタクリレートポリマー粒子を充填した新規カラム (GL-HilicAex, Hitachi Chemical Techno Service) を設計し，親水性相互作用と陰イオン交換作用を連続的に組み合わせた親水性相互作用/陰イオン交換クロマトグラフィータンデム質量分析法 (HILIC/AEX/MS/MS) を開発したので報告する．
包括的な親水性代謝物分析法を開発するために，耐アルカリ性の高いポリマー粒子系アミノカラムを用いて相互作用の調査，およびLCおよびMS条件の最適化に取り組んだ．陽イオン性 (ヌクレオシド，核酸塩基，アミノ酸)，陰イオン性 (有機酸，糖リン酸，ヌクレオチド，補酵素)の代表的な代謝物を選定し，各種分離条件に対する保持挙動の変化を調査した．その結果，(1) GL-HilicAexカラムは陰イオン性化合物に対して非常に強い保持を示すこと，(2) 水系移動相の重炭酸アンモニウム濃度の増加あるいはpHを塩基性に寄せることで，保持の強い陰イオン性化合物の溶出が早まること，(3) 陽イオン性化合物のlogPowと保持時間の間にはかなり強い相関があることが分かった．陽イオン性代謝物は，HILICによる分離モードによって溶出し，その後，AEXによる分離モードによって陰イオン性代謝物が溶出することを見出した．したがって，本手法は，ポリマー粒子系アミノカラムにおいて移動相pHを塩基性に調整し，添加剤の種類と濃度およびグラジエント条件を最適化することで，HILICとAEXの分離モードが段階的に働く新しいクロマト分離モードであった．続いて，測定対象とする化合物を拡張し検討した結果，陰イオン性代謝物と陽イオン性代謝物，合計416種に対して同時分離分析が可能であった．また，当該HILIC/AEX分析法の初期溶媒はアセトニトリルが主であり，試料を溶解させる溶媒は水/アセトニトリルあるいは水/メタノールとなる．そのため，Bligh-Dyer抽出後の水相試料 (水/メタノール = 45/55) に対して遠心濃縮・凍結乾燥などの工程を行わずに直接システムに注入することができ，遠心濃縮操作により加水分解等を受けやすい代謝物についても精確な生体試料の計測が可能であることが示された．以上の結果から，開発した新規HILIC/AEX/MS/MS分析法は親水性代謝物を対象としたターゲットおよびノンターゲットメタボローム解析において有効なツールとして活用されることが期待される．

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Event date： 2019.6

Language：English  

Venue：Atlanta, Georgia, USA   Country：United States  

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Event date： 2019.6

Language：English  

Venue：Atlanta, Georgia, USA   Country：United States  

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Event date： 2019.5

Language：Japanese  

Venue：茨城   Country：Japan  

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Event date： 2018.10

Language：Japanese  

Venue：山形   Country：Japan  

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Event date： 2018.6

Language：English  

Venue：San Diego, CA, USA   Country：United States  

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Event date： 2018.6

Language：English  

Venue：San Diego, CA, USA   Country：United States  

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Event date： 2017.11

Language：Japanese  

Country：Japan  

遺伝的にも環境的にも同一条件の細胞集団であっても，細胞老化や細胞周期，確率論的なゆらぎの影響を受け，個々の細胞が示す表現型は不均一であることが知られている．1細胞単位で細胞内分子の網羅的観測が可能となれば，量×時間×空間で構成されるビッグデータを基に生命システムの状態を記述でき，そのようなデータの解析は生命システムの動作原理の理解や疾患の発症機構の解明に貢献できることが期待される．通常のメタボローム分析においては，分析系の感度やその他の技術的限界から，組織 (10~15 mg) や複数細胞 (106~107個) などの集団サンプルを対象としてサンプル調製および測定が実施されてきた．一方，1細胞メタボローム解析についてはこれまでいくつかのグループによって検討されてきたが，実質的にはアフリカツメガエルの初期発生胚細胞 (直径~250 m，4 nL) のような比較的大きい細胞を用いた研究に限られている．そこで本研究では，動物細胞 (直径~20 m，2 pL) を測定試料として，ナノ液体クロマトグラフィータンデム質量分析 (nano-LC/MS/MS) を基盤とした代謝物の高感度計測技術および試料調製・試料導入技術を連携・連動させるシステムを構築し，最終的に，細胞分離からnano-LC/MS/MSへの導入までを一体化した1細胞メタボローム分析システムを開発することを目的とした．
はじめに，カラム内径のダウンサイジングによるLC/MS/MS分析系の高感度化について，親水性代謝物の保持が良好であったpentafluorophenylpropyl (PFPP) 担体を内径0.1 mmのフューズドシリカキャピラリーに充填したnano-LCカラムを用いて検証した．その結果，内径2.1 mmのセミミクロカラムを用いた汎用LC/MS/MS分析系と比べて，約100倍の感度向上を達成し，多くの代謝物をsub-fmolの絶対感度で検出可能であることが分かった．続いて，試料調製を微小空間内で実施するために，倒立型蛍光顕微鏡に低流量で溶液を吐出・吸引可能なナノシリンジポンプを搭載したナノピペットデバイスを試作した．さらに，本装置を用いて1細胞から100細胞程度をキャピラリーに導入し，直接nano-LC/MS/MS分析システムへ導入する技術の開発に成功した．最後に，当該技術を組み合わせた一連の分析システムを用いて，1細胞から100細胞程度のHeLa細胞の親水性代謝物分析を実施した．その結果，生細胞をそのままキャピラリーに導入し，細胞の溶解，分析カラムへの導入までを完全インラインで実施することで，アミノ酸のような比較的内生量の多い代謝物については，動物1細胞からでも検出可能であることを見出した．

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Event date： 2017.11

Language：Japanese  

Country：Japan  

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Event date： 2017.9

Language：Japanese  

Country：Japan  

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Event date： 2017.5

Language：Japanese  

Country：Japan  

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Event date： 2016.5

Language：Japanese  

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Type：Competition, symposium, etc. 

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