2021/06/24 更新

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サトウ ツトム
佐藤 努
SATO Tsutomu
所属
教育研究院 自然科学系 農学系列 教授
農学部 農学科 教授
職名
教授
外部リンク

学位

  • 農学博士 ( 2000年3月   新潟大学 )

研究キーワード

  • 生合成

  • 香料

  • イソプレノイド

  • テルペノイド

  • 天然物

  • テルペン

研究分野

  • ライフサイエンス / 生物有機化学  / 生合成

経歴(researchmap)

  • 新潟大学   自然科学系(農学部)   教授

    2020年5月 - 現在

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  • 新潟大学   自然科学系(農学部)   研究教授

    2019年12月 - 2020年4月

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  • 新潟大学   自然科学系(農学部)   准教授

    2007年4月 - 現在

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  • 新潟大学   自然科学系(農学部)   助教授

    2004年10月 - 2007年3月

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  • 新潟大学   農学部   助手

    2001年9月 - 2004年9月

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  • 新潟大学   農学部   日本学術振興会特別研究員(PD)

    2000年4月 - 2001年8月

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経歴

  • 新潟大学   農学部 農学科   教授

    2020年5月 - 現在

  • 新潟大学   農学部 農学科   准教授

    2017年4月 - 2020年5月

  • 新潟大学   自然科学研究科 生命・食料科学専攻   准教授

    2004年9月 - 2020年5月

  • 新潟大学   自然科学研究科 生命・食料科学専攻   准教授

    2004年9月 - 2020年5月

  • 新潟大学   応用生物化学科   准教授

    2004年9月 - 2017年3月

学歴

  • 新潟大学博士後期課程修了

    2000年3月

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所属学協会

委員歴

  • 日本農芸化学会   評議員  

    2016年4月 - 現在   

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    団体区分:学協会

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論文

  • Construction of an artificial system for ambrein biosynthesis and investigation of some biological activities of ambrein. 国際誌

    Yota Yamabe, Yukina Kawagoe, Kotone Okuno, Mao Inoue, Kanako Chikaoka, Daijiro Ueda, Yuko Tajima, Tadasu K Yamada, Yoshito Kakihara, Takashi Hara, Tsutomu Sato

    Scientific reports10 ( 1 ) 19643 - 19643   2020年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Ambergris, a sperm whale metabolite, has long been used as a fragrance and traditional medication, but it is now rarely available. The odor components of ambergris result from the photooxidative degradation of the major component, ambrein. The pharmacological activities of ambergris have also been attributed to ambrein. However, efficient production of ambrein and odor compounds has not been achieved. Here, we constructed a system for the synthesis of ambrein and odor components. First, we created a new triterpene synthase, "ambrein synthase," for mass production of ambrein by redesigning a bacterial enzyme. The ambrein yields were approximately 20 times greater than those reported previously. Next, an efficient photooxidative conversion system from ambrein to a range of volatiles of ambergris was established. The yield of volatiles was 8-15%. Finally, two biological activities, promotion of osteoclast differentiation and prevention of amyloid β-induced apoptosis, were discovered using the synthesized ambrein.

    DOI: 10.1038/s41598-020-76624-y

    PubMed

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  • Characterization of Class IB Terpene Synthase: The First Crystal Structure Bound with a Substrate Surrogate 査読

    Rafaella Stepanova, Hayato Inagi, Kei Sugawara, Kazuya Asada, Tomoyuki Nishi, Daijiro Ueda, Yoko Yasuno, Tetsuro Shinada, Kunio Miki, Masahiro Fujihashi, Tsutomu Sato

    ACS Chemical Biology15 ( 6 ) 1517 - 1525   2020年6月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:American Chemical Society (ACS)  

    DOI: 10.1021/acschembio.0c00145

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  • Insight into Isoprenoid Biosynthesis by Functional Analysis of Isoprenyl Diphosphate Synthases from Mycobacterium vanbaalenii and Mycobacterium tuberculosis. 査読 国際誌

    Tohru Abe, Sadamu Ozaki, Daijiro Ueda, Tsutomu Sato

    Chembiochem : a European journal of chemical biology21   2931 - 2938   2020年6月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Comprehensive functional analyses of E-isoprenyl diphosphate synthases (E-IDSs) from nonpathogenic Mycobacterium vanbaalenii have been performed. Mv0992 and Mv1577 represent a nonaprenyl diphosphate (E-C45 ) synthase and a geranylgeranyl diphosphate (E-C20 ) synthase, respectively. Although Mv3536 was identified as an E-C20 synthase using a single enzyme, co-incubation of Mv3536 and Z-IDSs (Mv4662 and Mv3822) strongly suggested it releases an intermediate geranyl diphosphate (E-C10 ) during a continuous condensation reaction. Mv0992 and Mv3536 functions differed from those of the previously reported pathogenic Mycobacterium tuberculosis homologues Rv0562 and Rv2173, respectively. Re-analysis of Rv0562 and Rv2173 demonstrated that their functions were similar to those of Mv0992 and Mv3536 (Rv0562: E-C45 synthase; Rv2173: E-C10-15 synthase). The newly proposed functions of Rv0562 and Rv2173 would be in the biosynthesis of menaquinone and glycosyl carrier lipids essential for growth. Furthermore, a reduced allylic diphosphate could be used as the Z-IDS of the Mv3822 substrate, thereby introducing a potentially novel pathway of cyclic sesquarterpene biosynthesis.

    DOI: 10.1002/cbic.202000235

    PubMed

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  • Adduct Formation of Delamanid with NAD in Mycobacteria. 査読 国際誌

    Mikayo Hayashi, Akihito Nishiyama, Ryuki Kitamoto, Yoshitaka Tateishi, Mayuko Osada-Oka, Yukiko Nishiuchi, Shaban A Kaboso, Xiuhao Chen, Mamoru Fujiwara, Yusuke Inoue, Yoshikazu Kawano, Masanori Kawasaki, Tohru Abe, Tsutomu Sato, Kentaro Kaneko, Kimiko Itoh, Sohkichi Matsumoto, Makoto Matsumoto

    Antimicrobial agents and chemotherapy64 ( 5 )   2020年4月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Delamanid (DLM), a nitro-dihydroimidazooxazole derivative currently approved for pulmonary multidrug-resistant tuberculosis (TB) therapy, is a prodrug activated by mycobacterial 7,8-didemethyl-8-hydroxy 5-deazaflavin electron transfer coenzyme (F420)-dependent nitroreductase (Ddn). Despite inhibiting the biosynthesis of a subclass of mycolic acids, the active DLM metabolite remained unknown. Comparative liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) analysis of DLM metabolites revealed covalent binding of reduced DLM with a nicotinamide ring of NAD derivatives (oxidized form) in DLM-treated Mycobacterium tuberculosis var. Bacille de Calmette et Guérin. Isoniazid-resistant mutations in the type II NADH dehydrogenase gene (ndh) showed a higher intracellular NADH/NAD ratio and cross-resistance to DLM, which were restored by complementation of the mutants with wild-type ndh Our data demonstrated for the first time the adduct formation of reduced DLM with NAD in mycobacterial cells and its importance in the action of DLM.

    DOI: 10.1128/AAC.01755-19

    PubMed

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  • Molecular Basis for Sesterterpene Diversity Produced by Plant Terpene Synthases 査読

    Qingwen Chen, Jianxu Li, Zhixi Liu, Takaaki Mitsuhashi, Yuting Zhang, Haili Liu, Yihua Ma, Juan He, Tetsuro Shinada, Tsutomu Sato, Yong Wang, Hongwei Liu, Ikuro Abe, Peng Zhang, Guodong Wang

    Plant Communications   100051 - 100051   2020年4月

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    掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:Elsevier BV  

    DOI: 10.1016/j.xplc.2020.100051

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  • Japanese Rice Wine can reduce psychophysical stress-induced depression-like behaviors and Fos expression in the trigeminal subnucleus caudalis evoked by masseter muscle injury in the rats. 査読

    Nakatani Y, Kakihara Y, Shimizu S, Kurose M, Sato T, Kaneoke M, Saeki M, Takagi R, Yamamura K, Okamoto K

    Bioscience, biotechnology, and biochemistry   1 - 11   2018年10月

  • An Aromatic Farnesyltransferase Functions in Biosynthesis of the Anti-HIV Meroterpenoid Daurichromenic Acid. 査読 国際誌

    Haruna Saeki, Ryota Hara, Hironobu Takahashi, Miu Iijima, Ryosuke Munakata, Hiromichi Kenmoku, Kazuma Fuku, Ai Sekihara, Yoko Yasuno, Tetsuro Shinada, Daijiro Ueda, Tomoyuki Nishi, Tsutomu Sato, Yoshinori Asakawa, Fumiya Kurosaki, Kazufumi Yazaki, Futoshi Taura

    Plant physiology178 ( 2 ) 535 - 551   2018年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Rhododendron dauricum produces daurichromenic acid, an anti-HIV meroterpenoid, via oxidative cyclization of the farnesyl group of grifolic acid. The prenyltransferase (PT) that synthesizes grifolic acid is a farnesyltransferase in plant specialized metabolism. In this study, we demonstrated that the isoprenoid moiety of grifolic acid is derived from the 2-C-methyl-d-erythritol-4-phosphate pathway that takes place in plastids. We explored candidate sequences of plastid-localized PT homologs and identified a cDNA for this PT, RdPT1, which shares moderate sequence similarity with known aromatic PTs. RdPT1 is expressed exclusively in the glandular scales, where daurichromenic acid accumulates. In addition, the gene product was targeted to plastids in plant cells. The recombinant RdPT1 regiospecifically synthesized grifolic acid from orsellinic acid and farnesyl diphosphate, demonstrating that RdPT1 is the farnesyltransferase involved in daurichromenic acid biosynthesis. This enzyme strictly preferred orsellinic acid as a prenyl acceptor, whereas it had a relaxed specificity for prenyl donor structures, also accepting geranyl and geranylgeranyl diphosphates with modest efficiency to synthesize prenyl chain analogs of grifolic acid. Such a broad specificity is a unique catalytic feature of RdPT1 that is not shared among secondary metabolic aromatic PTs in plants. We discuss the unusual substrate preference of RdPT1 using a molecular modeling approach. The biochemical properties as well as the localization of RdPT1 suggest that this enzyme produces meroterpenoids in glandular scales cooperatively with previously identified daurichromenic acid synthase, probably for chemical defense on the surface of R. dauricum plants.

    DOI: 10.1104/pp.18.00655

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  • Alicyclobacillus acidocaldarius Squalene-Hopene Cyclase: The Critical Role of Steric Bulk at Ala306 and the First Enzymatic Synthesis of Epoxydammarane from 2,3-Oxidosqualene. 査読 国際誌

    Natsumi Ideno, Shikou Umeyama, Takashi Watanabe, Mami Nakajima, Tsutomu Sato, Tsutomu Hoshino

    Chembiochem : a European journal of chemical biology19 ( 17 ) 1873 - 1886   2018年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    The acyclic molecule squalene (1) is cyclized into 6,6,6,6,5-fused pentacyclic hopene (2) and hopanol (3; ca. 5:1) through the action of Alicyclobacillus acidocaldarius squalene-hopene cyclase (AaSHC). The polycyclization reaction proceeds with regio- and stereochemical specificity under precise enzymatic control. This pentacyclic hopane skeleton is generated by folding 1 into an all-chair conformation. The Ala306 residue in AaSHC is conserved in known squalene-hopene cyclases (SHCs); however, increasing the steric bulk (A306T and A306V) led to the accumulation of 6,6,6,5-fused tetracyclic scaffolds possessing 20R stereochemistry in high yield (94 % for A306V). The production of the 20R configuration indicated that 1 had been folded in a chair-chair-chair-boat conformation; in contrast, the normal chair-chair-chair-chair conformation affords the tetracycle with 20S stereochemistry, but the yield produced by the A306V mutant was very low (6 %). Consequently, bulk at position 306 significantly affects the stereochemical fate during the polycyclization reaction. The SHC also accepts (3R) and (3S)-2,3-oxidosqualenes (OXSQs) to generate 3α,β-hydroxyhopenes and 3α,β-hydroxyhopanols through polycyclization initiated at the epoxide ring. However, the Val and Thr mutants generated epoxydammarane scaffolds from (3R)-OXSQ; this indicated that the polycyclization cascade started in these instances at the terminal double bond position. This work is the first to report the polycyclization of oxidosqualene starting at the terminal double bond.

    DOI: 10.1002/cbic.201800281

    Web of Science

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  • A Non-Enzymatic Pathway with Superoxide in Intracellular Terpenoid Synthesis. 査読 国際誌

    Daijiro Ueda, Saori Matsugane, Wataru Okamoto, Masayuki Hashimoto, Tsutomu Sato

    Angewandte Chemie (International ed. in English)57 ( 32 ) 10347 - 10351   2018年8月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Non-C5 -units terpenoids (norisoprenoids) with an acetonyl group are widely distributed in nature. However, studies on the biosynthesis of norisoprenoids are scarce. Now, the C33 norisoprenoid, (all-E)-farnesylfarnesylacetone, was identified from Bacillus spp. and it was elucidated for the first time that superoxide mediates the cleavage of menaquinones (vitamin K) to form norisoprenoids in saponification treatment. From in vivo experiments using gene-disrupted Bacillus subtilis strains targeted for enzymes responsible for menaquinone biosynthesis and for superoxide dismutase, it was suggested that the non-enzymatic cleavage (autoxidation) of menaquinone with superoxide resulted in norisoprenoid synthesis in Bacillus cells. Furthermore, the bioactive norisoprenoids, farnesylacetone and phytone, were produced in Bacillus cells by this novel synthesis system.

    DOI: 10.1002/anie.201805383

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  • Crystal structure and functional analysis of large-terpene synthases belonging to a newly found subclass. 査読 国際誌

    Masahiro Fujihashi, Tsutomu Sato, Yuma Tanaka, Daisuke Yamamoto, Tomoyuki Nishi, Daijiro Ueda, Mizuki Murakami, Yoko Yasuno, Ai Sekihara, Kazuma Fuku, Tetsuro Shinada, Kunio Miki

    Chemical science9 ( 15 ) 3754 - 3758   2018年4月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    Thousands of terpenes have been identified to date. However, only two classes of enzymes are known to be involved in their biosynthesis, and each class has characteristic amino-acid motifs. We recently identified a novel large-terpene (C25/C30/C35) synthase, which shares no motifs with known enzymes. To elucidate the molecular mechanism of this enzyme, we determined the crystal structure of a large-β-prene synthase from B. alcalophilus (BalTS). Surprisingly, the overall structure of BalTS is similar to that of the α-domain of class I terpene synthases although their primary structures are totally different from each other. Two novel aspartate-rich motifs, DYLDNLxD and DY(F,L,W)IDxxED, are identified, and mutations of any one of the aspartates eliminate its enzymatic activity. The present work leads us to propose a new subclass of terpene synthases, class IB, which is probably responsible for large-terpene biosynthesis.

    DOI: 10.1039/c8sc00289d

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  • Bioinspired synthesis of pentacyclic onocerane triterpenoids 査読

    Florian Bartels, Young J. Hong, Daijiro Ueda, Manuela Weber, Tsutomu Sato, Dean J. Tantillo, Mathias Christmann

    CHEMICAL SCIENCE8 ( 12 ) 8285 - 8290   2017年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ROYAL SOC CHEMISTRY  

    The first chemical synthesis of pentacyclic onocerane triterpenoids has been achieved. A putative biomimetic tricyclization cascade is employed to forge a fused decalin-/oxepane ring system. The synthetic route proceeds to (+)-cupacinoxepin in seven steps and to (+)-onoceranoxide in eight steps in the longest linear sequence, when starting from geranyl chloride and (+)-sclareolide. The bioinspired epoxypolyene cyclization is supported by computational and enzymatic studies.

    DOI: 10.1039/c7sc03903d

    Web of Science

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  • Analysis of the Catalytic Mechanism of Bifunctional Triterpene/Sesquarterpene Cyclase: Tyr167 Functions To Terminate Cyclization of Squalene at the Bicyclic Step 査読

    Liudmila Tenkovskaia, Mizuki Murakami, Kotone Okuno, Daijiro Ueda, Tsutomu Sato

    CHEMBIOCHEM18 ( 19 ) 1910 - 1913   2017年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:WILEY-V C H VERLAG GMBH  

    Onoceroids are a group of triterpenes biosynthesized from squalene or dioxidosqualene by cyclization from both termini. We previously identified a bifunctional triterpene/sesquarterpene cyclase (TC) that constructs a tetracyclic scaffold from tetraprenyl--curcumene (C-35) but a bicyclic scaffold from squalene (C-30) in the first reaction. TC also accepts the bicyclic intermediate as a substrate and generates tetracyclic and pentacyclic onoceroids in the second reaction. In this study, we analyzed the catalytic mechanism of an onoceroid synthase by using mutated enzymes. TCY167A produced an unnatural tricyclic triterpenol, but TCY167L, TCY167F, and TCY167W formed small quantities of tricyclic compounds, which suggested that the bulk size at Y167 contributed to termination of the cyclization of squalene at the bicyclic step. Our findings provide insight into the unique catalytic mechanism of TC, which triggers different cyclization modes depending on the substrate. These findings may facilitate the large-scale production of an onoceroid for which natural sources are limited.

    DOI: 10.1002/cbic.201700329

    Web of Science

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  • Biosynthesis of Sesterterpenes, Head-to-Tail Triterpenes, and Sesquarterpenes in Bacillus clausii: Identification of Multifunctional Enzymes and Analysis of Isoprenoid Metabolites 査読

    Daijiro Ueda, Hiroaki Yamaga, Mizuki Murakami, Yusuke Totsuka, Tetsuro Shinada, Tsutomu Sato

    CHEMBIOCHEM16 ( 9 ) 1371 - 1377   2015年6月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:WILEY-V C H VERLAG GMBH  

    We performed functional analysis of recombinant enzymes and analysis of isoprenoid metabolites in Bacillus clausii to gain insights into the biosynthesis of rare terpenoid groups of sesterterpenes, head-to-tail triterpenes, and sesquarterpenes. We have identified an (all-E)-isoprenyl diphosphate synthase (E-IDS) homologue as a trifunctional geranylfarnesyl diphosphate (GFPP)/hexaprenyl diphosphate (HexPP)/heptaprenyl diphosphate (HepPP) synthase. In addition, we have redefined the function of a tetraprenyl--curcumene synthase homologue as that of a trifunctional sesterterpene/triterpene/sesquarterpene synthase. This study has revealed that GFPP, HexPP, and HepPP, intermediates of two isoprenoid pathways (acyclic terpenes and menaquinones), are biosynthesized by one trifunctional E-IDS. In addition, GFPP/HexPP and HepPP are the primary substrates for the biosynthesis of acyclic terpenes and menaquinone-7, respectively.

    DOI: 10.1002/cbic.201500138

    Web of Science

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  • Cyclization of Squalene from Both Termini: Identification of an Onoceroid Synthase and Enzymatic Synthesis of Ambrein 査読

    Daijiro Ueda, Tsutomu Hoshino, Tsutomu Sato

    JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY135 ( 49 ) 18335 - 18338   2013年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:AMER CHEMICAL SOC  

    The onoceroids are triterpenoids biosynthesized from squalene or (3S)-2,3-oxidosqualene by cyclization from both termini. We recently revealed that tetraprenyl-beta-curcumene cyclase from Bacillus megaterium (BmeTC) is a bifunctional triterpene/sesquarterpene cyclase that converts head-to-tail tetraprenyl-beta-curcumene and tail-to-tail squalene into pentacyclic and bicyclic products, respectively, in vivo. Here, we reveal that BmeTC has an unprecedented catalytic function in cyclizing squalene from both termini and is the first onoceroid synthase. We also report the first onoceroids from bacterial origin. Our discoveries suggest that symmetric and asymmetric onoceroids could be biosynthesized by a single enzyme via an intermediate cyclized at one terminus of squalene. Furthermore, the new function of BmeTC enabled the synthesis of (+)-ambrein, a major constituent of ambergris that is difficult to obtain naturally, via a mutated squalene-hopene cyclase-catalyzed reaction from easily available squalene.

    DOI: 10.1021/ja4107226

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  • Enzymatic syntheses of unnatural head-to-tail pentacyclic triterpenes by tetraprenyl-beta-curcumene cyclase 査読

    Wataru Okamoto, Tsutomu Sato

    TETRAHEDRON LETTERS54 ( 49 ) 6747 - 6750   2013年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:PERGAMON-ELSEVIER SCIENCE LTD  

    Little is known of the biosynthesis of sesquarterpenes and the synthesis of unnatural terpenoids by sesquarterpene biosynthetic enzymes has not yet been reported. In this study, the enzymatic cyclization of head-to-tail acyclic triterpene beta-hexaprene a natural product isolated from Bacillus clausii-using tetraprenyl-beta-curcumene cyclase (TC) from Bacillus subtilis resulted in the formation of two unnatural pentacyclic triterpenes. It was revealed that B. subtilis TC, which forms tetracyclic terpenoid scaffold from tetraprenyl-beta-curcumene in vivo, could be used to construct the 6/6/6/6/6-fused pentacyclic scaffold in vitro, suggesting that the active site cavity of TC has sufficient space to accommodate this unnatural pentacyclic scaffold. This is the first report demonstrating the utility of a sesquarterpene cyclase toward the synthesis of unnatural terpenoids. (C) 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.

    DOI: 10.1016/j.tetlet.2013.09.135

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  • Identification of Novel Sesterterpene/Triterpene Synthase from Bacillus clausii 査読

    Tsutomu Sato, Hiroaki Yamaga, Shoji Kashima, Yusuke Murata, Tetsuro Shinada, Chiaki Nakano, Tsutomu Hoshino

    CHEMBIOCHEM14 ( 7 ) 822 - 825   2013年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:WILEY-V C H VERLAG GMBH  

    DOI: 10.1002/cbic.201300035

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  • Insight into the pathway for biosynthesis of sesquarterpenes in nonpathogenic Mycobacterium species: identification of heptaprenylcycli-14E,18E-diene 査読

    Tsutomu Sato, Eri Ono, Mami Nakajima, Chiaki Nakano, Tsutomu Hoshino

    TETRAHEDRON LETTERS53 ( 20 ) 2522 - 2524   2012年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:PERGAMON-ELSEVIER SCIENCE LTD  

    A new sesquarterpene, heptaprenylcycli-14E,18E-diene, was isolated from Mycobacterium chlorophenolicum cells grown up to the stationary phase. The absence of heptaprenylcycli-14Z,18E-diene indicates that only (E,E,E)-geranylgeranyl diphosphate may be utilized as an intermediate of sesquarterpene biosynthesis in the stationary phase, in contrast with the logarithmic growth phase in which both (E,E)-farnesyl diphosphate and (E,E,E)-geranylgeranyl diphosphate are used. Further, our findings suggest that the step-wise reduction of the polyprenyl group in sesquarterpene biosynthesis might proceed in a different order from that in chlorophyll biosynthesis. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

    DOI: 10.1016/j.tetlet.2012.03.019

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  • Bifunctional triterpene/sesquarterpene cyclase: tetraprenyl-β-curcumene cyclase is also squalene cyclase in Bacillus megaterium. 査読

    Sato T, Hoshino H, Yoshida S, Nakajima M, Hoshino T

    Journal of the American Chemical Society133 ( 44 ) 17540 - 17543   2011年11月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1021/ja2060319

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  • Sesquarterpenes (C35 terpenes) biosynthesized via the cyclization of a linear C35 isoprenoid by a tetraprenyl-β-curcumene synthase and a tetraprenyl-β-curcumene cyclase: identification of a new terpene cyclase. 査読

    Sato T, Yoshida S, Hoshino H, Tanno M, Nakajima M, Hoshino T

    Journal of the American Chemical Society133 ( 25 ) 9734 - 9737   2011年6月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)  

    DOI: 10.1021/ja203779h

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  • Triterpene Cyclases from Oryza sativa L.: Cycloartenol, Parkeol and Achilleol B Synthases 査読

    Ryousuke Ito, Kouya Mori, Ippei Hashimoto, Chiaki Nakano, Tsutomu Sato, Tsutomu Hoshino

    ORGANIC LETTERS13 ( 10 ) 2678 - 2681   2011年5月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:AMER CHEMICAL SOC  

    The gene products of AK121211, AK066327, and AK070534 from Oryza sativa encode cycloartenol, parkeol, and achilleol B synthases, respectively. Parkeol synthase is a unique enzyme that affords parkeol as a single product. Achilleol B synthase is the third seco-type triterpene cyclase identified to date, and triterpenes produced by this synthase include achilleol B (90%), tetracyclic (5.12%) and pentacyclic scaffolds (4.37%), and unidentified triterpenes (0.51%). The pathway for achilleol B biosynthesis is proposed.

    DOI: 10.1021/ol200777d

    Web of Science

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  • Characterization of the Ry3378c Gene Product, a New Diterpene Synthase for Producing Tuberculosinol and (13R, S)-Isotuberculosinol (Nosyberkol), from the Mycobacterium tuberculosis H37Rv Genome 査読

    Chiaki Nakano, Takahiro Ootsuka, Kazutoshi Takayama, Toshiaki Mitsui, Tsutomu Sato, Tsutomu Hoshino

    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY75 ( 1 ) 75 - 81   2011年1月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:TAYLOR & FRANCIS LTD  

    The Rv3377c and Rv3378c genes from Mycobacterium tuberculosis are specifically found in the virulent Mycobacterium species, but not in the avirulent species. The Rv3378c-encoded enzyme produced tuberculosinol 2 (5(6), 13(14)-halimadiene-15-ol), 13R-5a and 13S-isotuberculosinol 5b (5(6), 14(15)-halimadiene-13-ol) as its enzymatic products from tuberculosinyl diphosphate 3, indicating that the Rv3378c enzyme catalyzed the nucleophilic addition of a water molecule after the release of a diphosphate moiety. The three enzymatic products 2, 5a, and 5b were produced irrespective of the N- and C-terminal His-tagged Rv3378c enzymes, and of the maltose-binding protein fusion enzyme; the product distribution ratio was identical between the enzymes as 1:1 for 2:5, and 1:3 for 5a:5b. The successful separation of 5a and 5b by a chiral HPLC column provided the first complete assignments of H-1- and C-13-NMR data for 5a and 5b. The enzymatic mechanism for producing 2, 5a, and 5b is proposed here, and the optimal catalytic conditions and kinetic parameters, in addition to the divalent metal effects, are described. Site-directed mutagenesis of Asp into Asn, targeted at the DDXXD motif, resulted in significantly decreased enzymatic activity.

    DOI: 10.1271/bbb.100570

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  • Insight into C-35 terpene Biosyntheses by Nonpathogenic Mycobacterium Species: Functional Analyses of Three Z-Prenyltransferases and Identification of Dehydroheptaprenylcyclines 査読

    Tsutomu Sato, Kazuo Takizawa, Yuriko Onto, Hanayo Kudo, Tsutomu Hoshino

    CHEMBIOCHEM11 ( 13 ) 1874 - 1881   2010年9月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:WILEY-BLACKWELL  

    Nonpathogenic Mycobacterium species produce rare cyclic C-35 terpenes that are biosynthesized by cyclization of Z-type C-35 polyprenyl diphosphate. To provide deeper insight into the biosynthesis of C-35 terpenes, we carried out functional analyses of three Z-prenyltransferase homologues in M. vanbaalenii identified by genomic analysis. Mvan_3822, a novel bifunctional Z-prenyltransferase, biosynthesizes C-35-heptaprenyl diphosphate as a main product from (E,E)-farnesyl diphosphate (E,E-FPP) and (E,E,E)-geranylgeranyl diphosphate (E,E,E-GGPP), but produces a C-50-decaprenyl diphosphate from geranyl diphosphate. Mvan_1705 is a novel Z,E,E-GGPP synthase. In addition, novel cyclic C-35 terpenes, (14E)- and (14Z)-dehydroheptaprenylcycline, were identified as minor metabolites in nonpathogenic Mycobacterium cells. C-35 terpenes could be biosynthesized by two routes, in which E and Z geometric isomers of heptaprenyl diphosphate are produced from E,E-FPP and E,E,E-GGPP, and the prenylreductase responsible for the biosynthesis of C-35 terpenes could reduce both E and Z prenyl residues.

    DOI: 10.1002/cbic.201000328

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  • Substrate specificity of the CYC2 enzyme from Kitasatospora griseola: production of sclarene, biformene and novel bicyclic diterpenes by the enzymatic reactions of labdane- and halimane-type diterpene diphosphates 査読

    Chiaki Nakano, Tsutomu Hoshino, Tsutomu Sato, Tomonobu Toyomasu, Tohru Dairi, Takeshi Sassa

    TETRAHEDRON LETTERS51 ( 1 ) 125 - 128   2010年1月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:PERGAMON-ELSEVIER SCIENCE LTD  

    The enzymatic reaction of copalyl diphosphate (CDP), ent-CDP, syn-CDP, and tuberculosinyl diphosphate with the CYC2 enzyme from Kitasatospora griseola afforded sclarene, biformene, and novel diterpenes having a buta-1,3-diene moiety in the side chain. The substrate specificity of the CYC2 is discussed. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

    DOI: 10.1016/j.tetlet.2009.10.110

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  • Novel Compounds of Octahydroheptaprenyl Mycolic Acyl Ester and Monocyclic C-35-Terpene, Heptaprenylcycline B, from Non-Pathogenic Mycobacterium Species 査読

    Tsutomu Sato, Ryosuke Takagi, Yuriko Orito, Eri Ono, Tsutomu Hoshino

    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY74 ( 1 ) 147 - 151   2010年1月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:TAYLOR & FRANCIS LTD  

    A search for C-35-terpenes from non-saponified extracts of 12 non-pathogenic Mycobacterium species was carried out. Octahydroheptaprenyl mycolic acyl esters were isolated from M. chlorophenolicum cells which were also found from M. thermoresistibile, M. vanbaalenii, M. aichiense, M. smegmatis, and M. parafortuitum. This is the first report on a polyprenol esterified by a mycolate. A novel monocyclic C-35-terpene possessing a ketone, named heptaprenylcycline B, was isolated, which was detected from M. chlorophenolicum and M. vanbaalenii. The biosynthetic pathway to heptaprenylcycline B was investigated with ancymidol which acts as an inhibitor of a P450 monooxygenase. This experiment suggested that the P450 monooxygenase may be responsible for the production of heptaprenylcycline B.

    DOI: 10.1271/bbb.90669

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  • Reviewing the Polyolefin Cyclization Reaction of the C-35 Polyprene Catalyzed by Squalene-Hopene Cyclase 査読

    Tsutomu Hoshino, Yuko Kumai, Tsutomu Sato

    CHEMISTRY-A EUROPEAN JOURNAL15 ( 9 ) 2091 - 2100   2009年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:WILEY-V C H VERLAG GMBH  

    Squalene-hopene cyclase (SHC) catalyzes the polycyclization of squalene (C-30) to the pentacyclic hopene With regio- and stereochemical specificity. In this study, we reviewed the polycyclization reaction of the C-35 polyprenoid catalyzed by SHC. Surprisingly, our results completely disagreed with a previous publication in which it was reported that a hexacyclic skeleton was constructed as the single product in 10% yield (I. Abe. H. Tanaka, H. Noguchi, J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 14514-14515). Our experimental results showed that many tri- and tetracyclic products, up to 12. including novel carbocyclic cores, were generated in a high conversion ratio (97%), but no detectable amounts of the penta- and hexacycle were produced. The mechanisms for the formation of the C-31 Polyprene products isolated by us are discussed in this paper. The following four conformations were generated during the polycyclization cascade: chair-chair-boat, chair-chair-chair, chairchair-chair-boat, and chair-chair-chair-chair. Larger amounts of the false intermediates with 13 alpha-H (tricycle) and 17 alpha-H (tetracycle) were produced compared with the true intermediates (13 beta-H and 17 beta-H), which indicates that the C-35 polyprene cannot fold correctly in the enzyme cavity due to the extra C-5 unit appended to squalene. This Would have promoted the formation of the aborted cyclization products With tri- and tetracycles. In addition, the fact that no penta- or hexacyclic products were formed further indicates that SHC does not have sufficient space to accommodate the entire carbon framework of C-31.

    DOI: 10.1002/chem.200802142

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  • Biosynthesis of a novel cyclic C-35-terpene via the cyclisation of a Z-type C-35-polyprenyl diphosphate obtained from a nonpathogenic Mycobacterium species 査読

    Tsutomu Sato, Atsushi Kigawa, Ryosuke Takagi, Tomomi Adachi, Tsutomu Hoshino

    ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY6 ( 20 ) 3788 - 3794   2008年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ROYAL SOC CHEMISTRY  

    Lipid components from 12 nonpathogenic Mycobacterium species were analysed. A novel cyclic C35-terpene, named heptaprenylcycline 1, was obtained from 3 species, while octahydroheptaprenol 2, which has 3 Z-double bonds, was obtained from 6 species. The amounts of 1 and 2 in the cultured cells increased after the 4- to 6-d stationary phase. The yield of I was considerably greater at a higher temperature of 37 degrees C than at an optimal temperature of 28 degrees C, while that of 2 remained unchanged at all temperatures. A feeding experiment with D-[1(-13) C]glucose revealed that 1 was produced via isopentenyl diphosphate, which is a metabolite of glycolysis and the methylerythritol phosphate pathway. The conversion of octahydroheptaprenyl diphosphate 2-PP to 1 was successful by using the cell-free extracts of M. chlorophenolicum, demonstrating that 2-PP is the biosynthetic intermediate of 1. This is the first example of the biosynthesis of a natural terpene via the cyclisation of a linear C-35-isoprenoid. The substrate 2-PP for C-35-terpene cyclase has Z-type prenyl moieties; however, terpene cyclases usually employ E-type isoprenoids. The gene encoding the terpene cyclase that cyclises prenyl diphosphate containing Z-double bonds as the natural substrate has not yet been detected. Despite a careful search using the FASTA3 program, we could not detect any gene that is homologous to the known diphosphate-triggered type of mono-, sesqui- and diterpene cyclases in the genome of M. vanbaalenii, the DNA sequence of which has recently been elucidated. This suggests that a novel type of terpene cyclase might exist in the nonpathogenic Mycobacterium species.

    DOI: 10.1039/b808513g

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  • Sterol biosynthesis by a prokaryote: First in vitro identification of the genes encoding squalene epoxidase and lanosterol synthase from Methylococcus capsulatus 査読

    Chiaki Nakano, Akihiro Motegi, Tsutomu Sato, Masayuki Onodera, Tsutomu Hoshino

    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY71 ( 10 ) 2543 - 2550   2007年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:TAYLOR & FRANCIS LTD  

    Sterol biosynthesis by prokaryotic organisms is very rare. Squalene epoxidase and lanosterol synthase are prerequisite to cyclic sterol biosynthesis. These two enzymes, from the methanotrophic bacterium Methylococcus capsulatus, were functionally expressed in Escherichia coli. Structural analyses of the enzymatic products indicated that the reactions proceeded in a complete regio- and stereospecific fashion to afford (3S)2,3-oxidosqualene from squalene and lanosterol from (3S)-2,3-oxidosqualene, in full accordance with those of eukaryotes. However, our result obtained with the putative lanosterol synthase was inconsistent with a previous report that the prokaryote accepts both (3R)and (3S)-2,3-oxidosqualenes to afford 3-epi-lanosterol and lanosterol, respectively. This is the first report demonstrating the existence of the genes encoding squalene epoxidase and lanosterol synthase in prokaryotes by establishing the enzyme activities. The evolutionary aspect of prokaryotic squalene epoxidase and lanosterol synthase is discussed.

    DOI: 10.1271/bbb.70331

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  • Biosynthesis of violacein: a genuine intermediate, protoviolaceinic acid, produced by VioABDE, and insight into VioC function 査読

    Kouhei Shinoda, Takuji Hasegawa, Hiroaki Sato, Masaaki Shinozaki, Hirotomo Kuramoto, Yosuke Takamiya, Tsutomu Sato, Naoki Nikaidou, Takeshi Watanabe, Tsutomu Hoshino

    CHEMICAL COMMUNICATIONS ( 40 ) 4140 - 4142   2007年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ROYAL SOC CHEMISTRY  

    A biosynthetic intermediate of violacein produced by the mixed enzymes of VioABDE was elucidated to be 5-( 5- hydroxy1H- indol- 3- yl)- 3-( 1H- indol- 3- yl)- 1H- pyrrole- 2- carboxylic acid, named protoviolaceinic acid, indicating that VioC, responsible for the final biosynthetic step, works to oxygenate at the 2- position of the right side indole ring, and that the oxygenation reaction to form the central pyrrolidone core proceeds in a nonenzymatic fashion.

    DOI: 10.1039/b705358d

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  • Mycobacterium tuberculosis H37Rv3377c encodes the diterpene cyclase for producing the halimane skeleton 査読

    C Nakano, T Okamura, T Sato, T Dairi, T Hoshino

    CHEMICAL COMMUNICATIONS ( 8 ) 1016 - 1018   2005年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ROYAL SOC CHEMISTRY  

    The cloning and functional expression of Mycobacterium tuberculosis Rv3377c in Escherichia coli revealed that this gene encodes the diterpene cyclase for producing (+)-5(6),13-halimadiene-15-ol, which accepts geranylgeranyldiphosphate as the intrinsic substrate.

    DOI: 10.1039/b415346d

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  • Site-directed mutagenesis experiments on the putative deprotonation site of squalene-hopene cyclase from Alicyclobacillus acidocaldarius 査読

    T Sato, M Kouda, T Hoshino

    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY68 ( 3 ) 728 - 738   2004年3月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:TAYLOR & FRANCIS LTD  

    To provide insight into the catalytic mechanism for the final deprotonation reaction of squalene-hopene cyclase (SHC) from Alicyclobacillus acidocaldarius, mutagenesis experiments were conducted for the following ten residues: Thr41, Glu45, Glu93, Arg127, Trp133, Gln262, Pro263, Tyr267, Phe434 and Phe437. An X-ray analysis of SHC has revealed that two types of water molecules ("front water" and "back waters") were involved around the deprotonation site. The results of these mutagenesis experiments allow us to propose the functions of these residues. The two, residues of Gln262 and Pro263 probably work to keep away the isopropyl group of the hopanyl cation intermediate from the "front water molecule," that is, to place the "front water" in a favorable position, leading to the minimal production of by-products, i.e., hopanol and hop-21(22)-ene. The five residues of Thr41, Glu45, Glu93, Arg127 and Trp133, by which the hydrogen-bonded network incorporating the "back waters" is constructed, increase the polarization of the "front water" to facilitate proton elimination from the isopropyl moiety of the hopanyl cation, leading to the normal product, hop22(29)-ene. The three aromatic residues of Tyr267, Phe434 and Phe437 are likely to play an important role in guiding squalene from the enzyme surface to the reaction cavity (substrate channeling) by the strong affinity of their aromatic residues to the squalene substrate.

    DOI: 10.1271/bbb.68.728

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  • Squalene-hopene cyclase: final deprotonation reaction, conformational analysis for the cyclization of (3R,S)-2,3-oxidosqualene and further evidence for the requirement of an isopropylidene moiety both for initiation of the polycyclization cascade and for the formation of the 5-membered E-ring 査読

    T Hoshino, S Nakano, T Kondo, T Sato, A Miyoshi

    ORGANIC & BIOMOLECULAR CHEMISTRY2 ( 10 ) 1456 - 1470   2004年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ROYAL SOC CHEMISTRY  

    To provide insight into the polycyclization mechanism of squalene by squalene-hopene cyclase (SHC) from Alicyclobacilus acidocaldarius, some analogs of nor- and bisnorsqualenes were synthesized including the deuterium-labeled squalenes and incubated with the wild-type SHC, leading to the following inferences. (1) The deprotonation reaction for the introduction of the double bond of the hopene skeleton occurs exclusively from the Z-methyl group on the terminal double bond of squalene. (2) 3R-Oxidosqualene was folded in a boat conformation for the A-ring construction, while the 3S-form was in a chair structure. (3) The terminal two methyl groups are indispensable both for the formation of the 5-membered E-ring of the hopene skeleton and for the initiation of the polycyclization cascade, but the terminal Z-methyl group has a more crucial role for the construction of the 5-membered E-ring than the E-methyl group. (4) Some of the novel terpene skeletons, 36, 37, 39 and 40, were created from the analogs employed in this investigation.

    DOI: 10.1039/b401172d

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  • Deletion of the Gly600 residue of alicyclobacillus acidocaldarius squalene cyclase alters the substrate specificity into that of the eukaryotic-type cyclase specific to (3S)-2,3-oxidosqualene 査読

    T Hoshino, K Shimizu, T Sato

    ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION43 ( 48 ) 6700 - 6703   2004年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:WILEY-V C H VERLAG GMBH  

    DOI: 10.1002/anie.200461523

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  • Functional analyses of Tyr420 and Leu607 of Alicyclobacillus acidocaldarius squalene-hopene cyclase. Neoachillapentaene, a novel triterpene with the 1,5,6-trimethylcyclohexene moiety produced through folding of the constrained boat structure 査読

    T Sato, S Sasahara, T Yamakami, T Hoshino

    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY66 ( 8 ) 1660 - 1670   2002年8月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:TAYLOR & FRANCIS LTD  

    The functions of Tyr420 and Leu607 were analyzed by constructing various site-directed mutants. The mutation at position 420 into Ala and Gly gave bicyclic alpha-and gamma-polypodatetraene in significant amounts, but with a trace amount of tricyclic malabaricatriene. The kinetic data for and the product distribution of the Y420F mutant indicate that the major function of Tyr420 is to stabilize the 6/6-fused bicyclic cation. Mutation experiments on Leu607 demonstrate that the appropriate steric bulk size at position 607 is required to strongly bind with the product-like conformation formed during the polycyclization process. Introduction of the bulkiest Trp residue into 420 or 607 led to the production of a novel monocyclic triterpene having the (5R,6R)-1,5,6-trimethylcyclohexene ring, named neoachillapentaene, indicating that the enzymatic cyclization proceeded via a constrained boat structure. Folding of the squalene molecule into a boat conformation by squalene cyclase has not been reported before.

    DOI: 10.1271/bbb.66.1660

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  • Catalytic function of the residues of phenylalanine and tyrosine conserved in squalene-hopene cyclases 査読

    T Sato, T Hoshino

    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY65 ( 10 ) 2233 - 2242   2001年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:TAYLOR & FRANCIS LTD  

    Site-directed mutagenesis experiments on all the conserved residues of Phe and Tyr in all the known squalene-hopene cyclases (SHCs) were carried out to identify the active site residues of thermophilic Alicyclobacillus acidocaldarius SHC. The following functions are proposed on the basis of kinetic data and trapping of the prematurely cyclized products: (1) The Y495 residue probably amplifies the D376 acidity, which is assumed to work as a proton donor for initiating the polycyclization cascade, but its role is moderate. (2) Y609 possibly assists the function of F365, which has previously been assigned to exclusively stabilize the C-8 carbocation intermediate through cation-pi interaction. The Y609A mutant produced a partially cyclized bicyclic triterpene. (3) Y612 works to stabilize both the C10 and C8 carbocations, this being verified by the finding that mono- and bicyclic products were formed with the Y612A mutant. (4) F129 was first identified to play a crucial role in catalysis. (5) The three residues, Y372, V474 and Y540, are responsible for reinforcing the protein structure against thermal denaturation, Y474 being located inside QW motif 3.

    DOI: 10.1271/bbb.65.2233

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  • Functional analysis of Phe605, a conserved aromatic amino acid in squalene-hopene cyclases 査読

    T Hoshino, M Kouda, T Abe, T Sato

    CHEMICAL COMMUNICATIONS ( 16 ) 1485 - 1486   2000年

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ROYAL SOC CHEMISTRY  

    Incubation of squalene with the site-directed mutant F605A of squalene-hopene cyclase from Alicyclobacillus acidocaldarius yielded many triterpenes consisting of the 6/6/5-fused tri-, 6/6/6/5-fused tetra-, and 6/6/6/6/5-fused pentacyclic skeletons, the function of F605 being assignable for facilitating the ring expansion and for stabilizing the hopanyl C22-cation, possibly via cation-pi interactions.

    DOI: 10.1039/b004129g

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  • Functional analysis of the DXDDTA motif in squalene-hopene cyclase by site-directed mutagenesis experiments: Initiation site of the polycyclization reaction and stabilization site of the carbocation intermediate of the initially cyclized A-ring 査読

    T Sato, T Hoshino

    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY63 ( 12 ) 2189 - 2198   1999年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:TAYLOR & FRANCIS LTD  

    In order to clarify the function of the DXDDTA motif in squalene-hopene cyclase and to identify the acidic amino acid residues crucial for the catalysis, site-directed mutagenesis experiments were carried out. The following results were found: (1) residues D374 and D376 work for the initiation of polyolefin cyclization which arises from the proton attack on the terminal double bond; (2) residue D377 stabilizes C-10 carbocation of the initially cyclized A-ring intermediate, leading to subsequent B-ring closure, which was further verified by isolating the partially cyclized monocyclic product; (3) residues D313 and D447 outside the DXDDTA motif were identified as new active sites; (4)the H451 residue is likely to work in the protonated form to enhance the acidity of the carboxyl groups of D374 and/or D376.

    DOI: 10.1271/bbb.63.2189

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  • Functional analysis of phenylalanine 365 in hopene synthase, a conserved amino acid in the families of squalene and oxidosqualene cyclases 査読

    T Hoshino, T Sato

    CHEMICAL COMMUNICATIONS ( 19 ) 2005 - 2006   1999年10月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ROYAL SOC CHEMISTRY  

    Two bicyclic products were accumulated by the mutant F365A, showing the amino acid residue is located close to the transient C-8 carbocation intermediate in the active site cavity; the mutants of F365Y and F365W significantly accelerated the cyclization reaction at low temperatures.

    DOI: 10.1039/a905559b

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  • Kinetic studies on the function of all the conserved tryptophans involved inside and outside the QW motifs of squalene-hopene cyclase: Stabilizing effect of the protein structure against thermal denaturation 査読

    T Sato, T Hoshino

    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY63 ( 7 ) 1171 - 1180   1999年7月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:TAYLOR & FRANCIS LTD  

    Site-directed mutagenesis experiments were carried out to identify the responsibility of the eight QW motifs for the reaction catalyzed by squalene-hopene cyclase (SHC). Alterations of the conserved tryptophans, which are responsible for the stacking structure with glutamine, into aliphatic amino acids gave a significantly lower temperature for the catalytic optimum as for the mutageneses of QW motifs 4, 5a and 5b, which are specifically present in SHCs. However, there was no change in the optimal temperatures of the mutated SHCs targeted at the other five motifs 1, 2, 3, 5c and 6. Thus, reinforcement against heat denaturation can be proposed as a function of the three QW motifs 4, 5a and 5b, but no function could be identified for the QW motifs 1, 2, 3, 5c and 6, although they are commonly found in all the families of prokaryotic SHCs and eukaryotic oxidosqualene cyclases. On the other hand, the three conserved tryptophans of W169, W312 and W489, which are located inside the putative central cavity and outside the QW motifs, were identified as components of the active sites, but also had a function against thermal denaturation. The other two tryptophan residues of W142 and W558, which are located outside the QW motifs, were found not to be active sites, but also had a role for stabilizing the protein structure. It is noteworthy that the mutants replaced by phenylalanine had higher temperatures for the catalytic optimum than those replaced by aliphatic amino acids. The catalytic optimal pH values for all the mutants remained unchanged with an identical value of 6.0.

    DOI: 10.1271/bbb.63.1171

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  • On the cyclization mechanism of squalene: a ring expansion process of the five-membered D-ring intermediate 査読

    T Sato, T Abe, T Hoshino

    CHEMICAL COMMUNICATIONS ( 23 ) 2617 - 2618   1998年12月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:ROYAL SOC CHEMISTRY  

    Site-directed mutagenesis experiments with W169F, W169H and W489F for the squalene-hopene cyclase, and the formation of 10 possessing the five-membered D-ring and a tetrahydrofuran moiety as the enzyme product of the analogue 8 with a hydroxy group, strongly suggest that a ring expansion reaction from the five- to the six-membered ring is responsible for the D-ring formation of hopene.

    DOI: 10.1039/a806948d

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  • Overexpression of squalene-hopene cyclase by the pET vector in Escherichia coli and first identification of tryptophan and aspartic acid residues inside the QW motif as active sites 査読

    T Sato, Y Kanai, T Hoshino

    BIOSCIENCE BIOTECHNOLOGY AND BIOCHEMISTRY62 ( 2 ) 407 - 411   1998年2月

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    記述言語:英語   掲載種別:研究論文(学術雑誌)   出版者・発行元:TAYLOR & FRANCIS LTD  

    An overexpression system for squalene-hopene cyclase (SHC) was constructed by using the pET3a vector, which is responsible for high expression with help from the strong T7 promoter when incorporated into E. coli BL21(DE3). Site-directed mutagenesis experiments prove that two amino acid residues of tryptophan and aspartic acid inside the QW-motif 5 resided as active sites.

    DOI: 10.1271/bbb.62.407

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MISC

  • テルペン生合成酵素の研究とアンブレインへの応用 招待

    上田 大次郎, 佐藤 努

    The TAKASAGO times183   29 - 32   2019年5月

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  • セスクアテルペン環化酵素を基軸とするテルペン創出経路の開拓

    上田 大次郎, 山鹿 宏彰, 岡本 渉, 遠塚 悠輔, 品田 哲郎, 星野 力, 佐藤 努

    天然有機化合物討論会講演要旨集56 ( 0 )   2018年7月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:天然有機化合物討論会実行委員会  

    <p>はじめに</p><p>我々は、天然物探索から新規C<sub>35</sub>テルペンを発見して以来、C<sub>35</sub>テルペンに着目して研究を行っている<sup>1-6)</sup>。50,000種類を超えるテルペン類の中で、C<sub>35</sub>テルペンには長らく特別な分類名がなかったが、直鎖状C<sub>35</sub>イソプレノイドの環化を経る経路を酵素・遺伝子レベルで初めて証明し、「セスクアテルペン」と命名した<sup>2-5)</sup>。本経路には、1990年代から数多く見出されてきたテルペン環化酵素の一次構造と類似性をもたない「新型」テルペン環化酵素(テトラプレニル-β-クルクメン合成酵素:TS)が関わることを明らかにした(Scheme 1)<sup>2-5)</sup>。また、Bacillus megaterium由来のテトラプレニル-β-クルクメン環化酵素(TC)は、C<sub>35</sub>とC<sub>30</sub>の基質から各々4環と2環を形成する二機能性テルペン環化酵素であることを証明した<sup>2,3,6)</sup>。異なる2種類のテルペンを生体内で生合成する初めてのテルペン環化酵素であった(Scheme 1)<sup>2,3,6)</sup>。</p><p>今回、セスクアテルペン環化酵素であるTSおよびTCに関する研究をさらに展開し、テルペン創出経路を開拓したので報告する。</p><p> </p><p>1)TSホモログのゲノムマイニングによる新規セスタテルペン・新規トリテルペンの発見<sup>7)</sup></p><p>TSホモログは、様々なバクテリアにおいて機能未知遺伝子として存在している。今回、手始めに好アルカリ性のBacillus clausiiのもの(Bcl-TS)をターゲットにした。B. clausiiゲノムにおいてTSホモログが存在するにも関わらず、菌体から化合物1が検出されなかった。一方、テルペン類と考えられる未知脂質(5と6)がGC-MSによって検出されたため、それらを単離・構造決定した。その結果、新規非環状セスタテルペン(5)と新規非環状トリテルペン(6)であることが判明した。各々β-geranylfarneseneおよびβ-hexapreneと命名した。</p><p>B. clausiiゲノムにおいてBcl-TS以外にテルペン合成酵素ホモログが存在しないことから、Bcl-TSが化合物5と6の生合成に寄与していることが考えられた。Bcl-TSの大腸菌発現系を構築後、精製Bcl-TSによってGFPP(C<sub>25</sub>)とHexPP(C<sub>30</sub>)から各々5と6が生成されることをin vitroで証明した(Scheme 2)。</p><p>Table 1に示したように、化合物5と6は多くの好アルカリ性Bacillusに分布していた<sup>7)</sup>。以前、B. alcalophilusのような好アルカリ性Bacillusはスクアレン3やデヒドロスクアレンを生産することが報告されていたが<sup>8)</sup>、我々は化合物5と6が生産されていると訂正した。</p><p> 本研究によって、TSホモログがセスクアテルペン(C<sub>35</sub>)だけでなくC<sub>25</sub>やC<sub>30</sub>のような様々なテルペン合成酵素のファミリーであることが判明した。今後も、TSホモログのゲノムマイニングによって多くの新規テルペンを発見できるのではないかと期待している。</p><p>2)TCによる</p><p>(View PDFfor the rest of the abstract.)</p>

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  • Large‐terpene合成酵素の酵素的諸性質の解析と部位特異的変異

    西智之, 菅原啓, 小川佳央, 高橋宏忠, 上田大次郎, 藤橋雅宏, 三木邦夫, 保野陽子, 品田哲郎, 佐藤努

    日本蛋白質科学会年会プログラム・要旨集18th   50   2018年5月

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    記述言語:日本語  

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  • Large‐terpene合成酵素の酵素的諸性質の解析と部位特異的変異

    菅原啓, 西智之, 小川佳央, 高橋宏忠, 上田大次郎, 藤橋雅宏, 三木邦夫, 保野陽子, 品田哲郎, 佐藤努

    日本農芸化学会大会講演要旨集(Web)2018   ROMBUNNO.3A17p02 (WEB ONLY)   2018年3月

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    記述言語:日本語  

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  • Large‐terpene合成酵素の結晶構造解析

    藤橋雅宏, 佐藤努, 田中勇真, 山本大輔, 西智之, 上田大次郎, 村上瑞気, 保野陽子, 関原あい, 福和真, 品田哲郎, 三木邦夫

    日本農芸化学会大会講演要旨集(Web)2018   ROMBUNNO.3A17p01 (WEB ONLY)   2018年3月

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    記述言語:日本語  

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  • 龍涎香に関する研究

    上田大次郎, 佐藤努

    季刊香料 ( 273 ) 53‐59   2017年3月

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    記述言語:日本語  

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  • 龍涎香に関する研究

    上田 大次郎, 佐藤 努

    香料 ( 273 ) 53 - 59   2017年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本香料協会  

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  • 龍涎香の主成分アンブレインの酵素合成

    上田大次郎, 星野力, 佐藤努

    Aroma Res16 ( 2 ) 142 - 143   2015年5月

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    記述言語:日本語  

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  • 3P-269 Bacillus clausiiにおけるセスタテルペン、Head-to-tail型トリテルペン、セスクアテルペンの生合成 : 多機能性酵素の同定とイソプレノイド代謝物の解析(生合成,天然物化学,一般講演)

    上田 大次郎, 山鹿 宏彰, 村上 瑞気, 遠塚 悠輔, 品田 哲郎, 佐藤 努

    日本生物工学会大会講演要旨集67   338 - 338   2015年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:日本生物工学会  

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    その他リンク: http://dl.ndl.go.jp/info:ndljp/pid/10536373

  • 龍涎香の主成分アンブレインの酵素合成

    上田大次郎, 星野力, 佐藤努

    バイオサイエンスとインダストリー72 ( 5 ) 410 - 411   2014年9月

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    記述言語:日本語  

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  • セスクアテルペン環化酵素を基軸とするテルペン創出経路の開拓

    上田 大次郎, 山鹿 宏彰, 岡本 渉, 遠塚 悠輔, 品田 哲郎, 星野 力, 佐藤 努

    天然有機化合物討論会講演要旨集56 ( 0 ) Oral18   2014年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:天然有機化合物討論会実行委員会  

    <p>はじめに</p><p>我々は、天然物探索から新規C<sub>35</sub>テルペンを発見して以来、C<sub>35</sub>テルペンに着目して研究を行っている<sup>1-6)</sup>。50,000種類を超えるテルペン類の中で、C<sub>35</sub>テルペンには長らく特別な分類名がなかったが、直鎖状C<sub>35</sub>イソプレノイドの環化を経る経路を酵素・遺伝子レベルで初めて証明し、「セスクアテルペン」と命名した<sup>2-5)</sup>。本経路には、1990年代から数多く見出されてきたテルペン環化酵素の一次構造と類似性をもたない「新型」テルペン環化酵素(テトラプレニル-β-クルクメン合成酵素:TS)が関わることを明らかにした(Scheme 1)<sup>2-5)</sup>。また、Bacillus megaterium由来のテトラプレニル-β-クルクメン環化酵素(TC)は、C<sub>35</sub>とC<sub>30</sub>の基質から各々4環と2環を形成する二機能性テルペン環化酵素であることを証明した<sup>2,3,6)</sup>。異なる2種類のテルペンを生体内で生合成する初めてのテルペン環化酵素であった(Scheme 1)<sup>2,3,6)</sup>。</p><p>今回、セスクアテルペン環化酵素であるTSおよびTCに関する研究をさらに展開し、テルペン創出経路を開拓したので報告する。</p><p> </p><p>1)TSホモログのゲノムマイニングによる新規セスタテルペン・新規トリテルペンの発見<sup>7)</sup></p><p>TSホモログは、様々なバクテリアにおいて機能未知遺伝子として存在している。今回、手始めに好アルカリ性のBacillus clausiiのもの(Bcl-TS)をターゲットにした。B. clausiiゲノムにおいてTSホモログが存在するにも関わらず、菌体から化合物1が検出されなかった。一方、テルペン類と考えられる未知脂質(5と6)がGC-MSによって検出されたため、それらを単離・構造決定した。その結果、新規非環状セスタテルペン(5)と新規非環状トリテルペン(6)であることが判明した。各々β-geranylfarneseneおよびβ-hexapreneと命名した。</p><p>B. clausiiゲノムにおいてBcl-TS以外にテルペン合成酵素ホモログが存在しないことから、Bcl-TSが化合物5と6の生合成に寄与していることが考えられた。Bcl-TSの大腸菌発現系を構築後、精製Bcl-TSによってGFPP(C<sub>25</sub>)とHexPP(C<sub>30</sub>)から各々5と6が生成されることをin vitroで証明した(Scheme 2)。</p><p>Table 1に示したように、化合物5と6は多くの好アルカリ性Bacillusに分布していた<sup>7)</sup>。以前、B. alcalophilusのような好アルカリ性Bacillusはスクアレン3やデヒドロスクアレンを生産することが報告されていたが<sup>8)</sup>、我々は化合物5と6が生産されていると訂正した。</p><p> 本研究によって、TSホモログがセスクアテルペン(C<sub>35</sub>)だけでなくC<sub>25</sub>やC<sub>30</sub>のような様々なテルペン合成酵素のファミリーであることが判明した。今後も、TSホモログのゲノムマイニングによって多くの新規テルペンを発見できるのではないかと期待している。</p><p>2)TCによる</p><p>(View PDFfor the rest of the abstract.)</p>

    DOI: 10.24496/tennenyuki.56.0_Oral18

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  • セスクアテルペン環化酵素の部位特異的変異および非天然型テルペンの創出

    上田大次郎, 岡本渉, 山本彩乃, 遠塚悠輔, 品田哲郎, 仲野千秋, 佐藤努

    香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会講演要旨集57th   369 - 371   2013年10月

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    記述言語:日本語  

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  • Unique biosynthesis of sesquarterpenes (C35 terpenes) 査読

    Tsutomu Sato

    Bioscience, Biotechnology and Biochemistry77 ( 6 ) 1155 - 1159   2013年

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    記述言語:英語   掲載種別:書評論文,書評,文献紹介等  

    To the best of my knowledge, only 19 cyclic and 8 linear C35 terpenes have been identified to date, and no family name was assigned to this terpene class until recently. In 2011, it was proposed that these C35 terpenes should be called sesquarterpenes. This review highlights the biosynthesis of two kinds of sesquarterpenes (C35 terpenes) that are produced via cyclization of a linear C35 isoprenoid in Bacillus and Mycobacterium species. In Bacillus species, a new type of terpene cyclase that has no sequence homology with any known terpene synthases, as well as a bifunctional terpene cyclase that biosynthesizes two classes of cyclic terpenes with different numbers of carbons as natural products, have been identified. On the other hand, in Mycobacterium species, the first bifunctional Z-prenyltransferase has been found, but a novel terpene cyclase and a unique polyprenyl reductase remain unidentified. The identification of novel enzyme types should lead to the discovery of many homologous enzymes and their products including novel natural compounds. On the other hand, many enzymes responsible for the biosynthesis of natural products have low substrate specificities in vitro. Therefore, to find novel natural products present in organisms, the multifunctionality of enzymes in the biosynthetic pathway of natural products should be analyzed.

    DOI: 10.1271/bbb.130180

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  • ユニークなセスクアテルペン(C_<35>テルペン)生合成経路 : 今までに類のない新型と二機能性テルペン環化酵素の同定

    佐藤 努

    化学と生物50 ( 9 ) 622 - 623   2012年9月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:公益社団法人 日本農芸化学会  

    DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.50.622

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  • 17 細菌由来のsesquarterpenes(C_<35>テルペン) : ユニークな生合成酵素の同定と新規天然物探索(口頭発表の部)

    佐藤 努, 中島 真美, 星野 力, 星野 紘子, 吉田 悟, 滝沢 和央, 折戸 悠梨子, 高木 亮輔, 丹野 瑞樹, 工藤 はなよ, 小野 恵梨

    天然有機化合物討論会講演要旨集53 ( 0 ) 97 - 102   2011年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:天然有機化合物討論会実行委員会  

    In this study, mono- and pentacyclic C_<35> terpenes from Bacillus subtilis were biosynthesized via the cyclization of C_<35> isoprenoid by using purified enzymes, including the first identified new terpene cyclase, tetrapreny1-13-curcumene synthase, that shows no sequence homology to any of the known terpene cyclases. Based on these findings, we propose that these C_<35> terpenes are called the new family of "sesquarterpenes." This study demonstrated that a tetrapreny1-β-curcumene cyclase (TC) from B. subtilis, which was originally identified as a sesquarterpene cyclase converting a head-to-tail type of monocycle to a pentacycle, also cyclized a tail-to-tail type of linear squalene into a bicyclic triterpenol, 8α-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene. The 8α-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene was found to be a natural triterpene from B. megaterium, suggesting that the TC is bifunctional, cyclizing both tetrapreny1-α-curcumene and squalene in vivo. This is the first report describing the bifunctional terpene cyclase, which biosynthesizes 2 classes of cyclic terpenes with different numbers of carbons as natural products in the organism. Non-pathogenic Mycobacterium species also produce cyclic sesquarterpenes, which are biosynthesized via cyclization of Z-type C_<35> polyprenyl diphosphate. To provide deeper insight into the biosynthesis of sesquarterpenes, we carried out functional analyses of three Z-prenyltransferase homologues in M vanbaalenii identified by genomic analysis. Mvan_3822, a novel bi-functional Z-prenyltransferase, biosynthesizes C_<35>-heptaprenyl diphosphate as a main product from E,E-FPP and E,E,E-GGPP, but produces a C_<50>-decaprenyl diphosphate from GPP. Mvan_1705 is a novel Z,E,E-GGPP synthase. In addition, novel cyclic C_<35>-terpenes, 14E- and 14Z-dehydroheptaprenylcycline, were identified as minor metabolites in non-pathogenic Mycobacterium cells. Sesquarterpenes could be biosynthesized by two routes, in which E- and Z-geometric isomers of heptaprenyl diphosphate are produced from E,E-FPP and E,E,E-GGPP, and the prenylreductase responsible for the biosynthesis of sesquarterpenes may work to reduce both E- and Z-prenyl residues. The studies on sesquarterpenes promise to be an attractive field for expanding our understanding of the terpene world.

    DOI: 10.24496/tennenyuki.53.0_97

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  • P-85 非病原性Mycobacterium属細菌から得られた新規環状C_<35>テルペンのZ型C_<35>ポリプレニル二リン酸の環化反応による生合成(ポスター発表の部)

    佐藤 努, 木川 敦史, 高木 亮輔, 足立 知美, 星野 力

    天然有機化合物討論会講演要旨集50 ( 0 ) 517 - 522   2008年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:天然有機化合物討論会実行委員会  

    Lipid components from 12 nonpathogenic Mycobacterium species were analysed. A novel cyclic C_<35>-terpene, named heptaprenylcycline 1, was obtained from 3 species, while octahydroheptaprenol 2, which has 3 Z-double bonds, was obtained from 6 species. The amounts of 1 and 2 in the cultured cells increased after the 4- to 6-d stationary phase. The yield of 1 was considerably greater at a higher temperature of 37℃ than at an optimal growth temperature of 28℃, while that of 2 remained unchanged at all the temperatures (20-40℃). A feeding experiment with D-[1-^<13>C] glucose revealed that 1 was produced via isopentenyl diphosphate, which is a metabolite of glycolysis and the methylerythritol phosphate pathway. The conversion of octahydroheptaprenyl diphosphate 2-PP to 1 was successful by using the cell-free extracts of M. chlorophenolicum, demonstrating that 2-PP is the biosynthetic intermediate of 1. This is the first example of the biosynthesis of a natural terpene via the cyclisation of a linear C_<35>-isoprenoid. The substrate 2-PP has Z-type prenyl moieties; however, terpene cyclases usually employ E-type isoprenoids. The gene encoding the terpene cyclase that cyclises prenyl diphosphate containing Z-double bonds has not been reported hitherto. Despite a careful search using the FASTA3 program, we could not detect any gene homologous to the known diphosphate-triggered type of mono-, sesqui- and diterpene cyclases in the genome of M. vanbaalenii, the DNA sequence of which has recently been elucidated. This suggests that a novel type of terpene cyclase might exist in the nonpathogenic Mycobacterium species.

    DOI: 10.24496/tennenyuki.50.0_517

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  • 4 結核菌に見いだされたハリマン骨格の新規ジテルペン : クローニング、機能解析、基質特異性及び生物活性(口頭発表の部)

    仲野 千秋, 岡村 智雄, 佐藤 努, 原 崇, 大利 徹, 豊増 知伸, 佐々 武史, 星野 力

    天然有機化合物討論会講演要旨集48 ( 0 ) 19 - 24   2006年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:天然有機化合物討論会実行委員会  

    Based upon the genomic database of Mycobacterium tuberculosis H37Rv, the gene Rv3377c,which is a putative terpene cyclase, was amplified by PCR and ligated into BamH I/Hind III site of pET 22b(+), and expressed in E. coli. BL21(DE3). The expressed Rv3377c gene product is almost insoluble (inclusion body), but coexpression of Rv3377c and chaperon in E. coli afforded the gene product as an active form. The functionally expressed gene product had an enzyme activity only for geranylgeranyl diphosphate (GGPP), but inert to geranyl-pp (GPP), farnesyl-pp (FPP), squalene and oxidosqulaene. The structural analysis of the enzymatic product revealed that this enzyme encodes the diterpene cyclase for producing the halimane diterpene skeleton. We named tuberculosinol 1 for the enzyme product. The detailed investigation on the gene product indicated that the actual product by the Rv3377c enzyme was tuberculosinol diphosphate 2. Cyclic diterpene skeletons are usually constructed after removing the PP functional group. After the trials to find the dephosphorylating enzyme, it has turned out that the flanking gene Rv3378c is responsible for the dephosphorylation reaction of 2, yielding the hydroxylated product (isotuberculosinol 3) and 1 resulting from a water attack. Both of the Rv3377c and Rv3378c have been found only the pathogenic species, but not in the non-pathogenic one. Recently, Russell and coworkers reported that the survival of Mycobacterium tuberculosis in the macrophage was attenuated by the gene disruption Thus, the two genes may be closely related to the pathogenicity. We evaluated the effect of 1 on phagocytic activity against zymosan, a yeast cell wall component that produces inflammation, using human macrophage-like U937 cells. Fluorescence microscopic analysis revealed that the phagocytosis of FITC-labeled zymosan by U937 cells treated with 10μM of 1 was reduced by about 50% compared to the cells without treatment. We discuss the detailed enzyme characterization including the kinetic data and substrate specificities. The substrate specificity of the Rv3378c enzyme was remarkably broad as well as cyc2, which was found in Streptomyces griseolosporeus. The Rv3378c and cyc2 accepted copalyl-PP (CDP), ent-CDP and syn-CDP as substrate, leading to the successful construction of a variety of diterpene skeletons.

    DOI: 10.24496/tennenyuki.48.0_19

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  • オキシドスクアレン-ラノステロール環化酵素欠損型の酵母変異株の取得

    佐藤 努, 星野 力

    新潟大学農学部研究報告56 ( 2 ) 113 - 118   2004年3月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:新潟大学農学部  

    我々はオキシドスクアレン-ラノステロール環化酵素(OLC)の触媒機構を解明するため、酵母の発現糸を構築することを計画した。しかし、野生型の酵母は自身のOLCを持っていることから、そのまま発現宿主として用いることはできない。したがって、 OLC欠損型の酵母変異株を取得することを目的に実験を行った。酵母OLC欠損型二倍体から胞子形成を経て一倍体を分離した。得られた株(3-5-1)について、抗生物質に対する抵抗性の調査や脂質成分の分析そしてOLCの酵素活性の検定を行った。全ての結果は、 3-5-1株がOLC欠損型一倍体であることを示唆していた。今後、 3-5-1株は外来OLCの発現宿主として利用することができると考えられる。In order to investigate the catalytic mechanism of oxidosqualene-lanosterol cyclase (OLC), we have planed to construct the expression systenl of OLC in yeast Saccharomyces cerevtsiae. However, wild-type yeast can not be used as the expression host of OLC from o山er organism, because yeasts naturally have its own OLC. Therefore, we made experiments to obtain the yeast OLC deficient mutant. The OLC deficient haploid was separated from the OLC deficient diploid after the sporulation. The obtained microorganism, named 3-5-1, was confirmed to be OLC deficient haploid by checking the resistance for antibiotics, analyzing the components of lipid and assaying the OLC activity. The strain, named 3-5-1, may be able to be used as the expression host of OLC from other organism in future.

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    その他リンク: http://hdl.handle.net/10191/25024

  • Candida albicans由来のオキシドスクアレン-ラノステロール環化酵素の大腸菌における発現について

    佐藤 努, 星野 力

    新潟大学農学部研究報告56 ( 2 ) 105 - 112   2004年3月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:新潟大学農学部  

    古くから、オキシドスクアレン-ラノステロール環化酵素(OLC)の研究が成されてきているが、酵素アミノ酸残基レベルでの触媒機構こついては不明な点が数多く残されたままである。その解明には、異種細胞での高発現系の構築が必須であり、当面の課題となってきている。我々は、大腸菌におけるCandida albicans由来OLCの高発現系の構築を目的として実験を行った。まず、天然型のOLCを大腸菌で発現させた。しかし、不溶性であり、酵素活性も検出できなかった。次に、他の酵素の研究における可溶化の成功例やスクアレンーホペン環化酵素の研究を通して得た知見を参考にして、 TrxまたはDsb融合型、 N末端削除型、 QWモチーフ改変型の合計9種頬のOLCを大腸菌で発現させてみた。しかし、不溶性のままであり、酵素活性も検出できなかった。様々な方法によってOLCを大腸菌で発現させたにも関わらず、不溶性の問題を解決できなかったことから、 OLCの発現宿主には酵母や昆虫細胞などの真核生物を利用する必要があることが示唆された。

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    その他リンク: http://hdl.handle.net/10191/25023

  • スクアレン : ホペン環化酸素に保存されているフェニルアラニン残基とチロシン残基の触媒機能

    佐藤 努, 星野 力

    日本農芸化学会誌77 ( 4 ) 430 - 431   2003年4月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:公益社団法人 日本農芸化学会  

    DOI: 10.1271/nogeikagaku1924.77.430

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  • Squalene-hopene cyclase: catalytic mechanism and substrate recognition 査読

    T Hoshino, T Sato

    CHEMICAL COMMUNICATIONS ( 4 ) 291 - 301   2002年

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    記述言語:英語   出版者・発行元:ROYAL SOC CHEMISTRY  

    Rapid progress on the catalytic mechanism and substrate recognition by squalene-hopene cyclase, which has occurred only in the last several years, is reported. A series of site-directed mutation experiments and some squalene analogues have provided deep insight into the polycyclization mechanism and catalytic sites in conjunction with the information from X-ray crystal data.

    DOI: 10.1039/b108995c

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  • 34 部位特異的変異手法に基づいたスクアレン閉環酵素の触媒反応機構の解析(口頭発表の部)

    星野 力, 佐藤 努, 甲田 政則, 大橋 主称, 阿部 孝政

    天然有機化合物討論会講演要旨集41 ( 0 ) 199 - 204   1999年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:天然有機化合物討論会実行委員会  

    Squalene cyclization mechanism and the active sites of the cyclase are discussed on the basis of the site-directed mutagenesis experiments. 1. DXDDTA motif: the initiation of the polycyclization and stabilization of carobocation intermediate of the initialy formed A-ring through the carboxylate anion of D377. 2. Phe365 stabilizes the C-8 carbocation intermediate of A/B-fused ring system through cation/π interaction. This interaction was confirmed by constructing the mutants F365Y and F365W; these mutants accelerated the reaction velocity and the significant lowering of activation energy for the polycyclization reaction. Tyr420 is also responsible for the formation of B-ring. 3. Phe 601is crucial for the construction of the 6-membered C/D-ring system. The mutant F601A produced the partially cyclized tricyclic 6/6/5-fused13,14 and tetracyclic 6/6/6/5-fused 18. These products could be formed by a Markovnikov closure and indicated the involvements of ring-expansion processes from the 5-membered into the 6-membered ring system for the construction of the C/D-ring system. Compound 18 was also isolated from the mutant W169F and W169H. The presumed carbocationic intermediates 12 and 17 was trapped by using the substrate analogues 27 and 32(34), respectively, with a high nucleophilic hydroxyl group, resulting in the formation of 31 and 35. Thus, we propose that the polycyclization mechanism proceeds via two ring-expansion steps for the formation of C- and D-rings, leading to the formation of anti-Markovnikov adduct 2. 4. The mutant I261A produced a series of carbocationic intermeidates 6/6/5-, 6/6/6/5-, and 6/6/6/6-fused ring systems, giving further insight into the polycycliation mechansim. In the enzymatic products, unnatural natural products are included. 5. Phe 605 would stabilize the cations of 17, 19 and 20 through cation-π interaction, as verified by the isolations of 6/6/6/5- and 6/6/6/6/5-ring skeletons. 6. The methyl at C10-posisiton of 1 is crucial to the correct folding in the active center, this being demonstrated by the substrate analouge 40. The proposed cyclization mechanism has been verified both by the kinetic measurments and by the isolation of the differently cyclized products resulting from each stage of the carbocationic intermediates. Alteration of the cyclase active sites afforded multiple triterpenes in addtion to the understanding of the fundamental issues of squalene cyclization mechanism, suggesting the possibility that we will be able to generate novel triterpenes (unnatural natural products) by rational genetic engineering of squalene cyclase.

    DOI: 10.24496/tennenyuki.41.0_199

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  • 25 スクアレン及びオキシドスクアレン閉環酵素の基質認識について : 基質中のメチル基が活性コンフォメイションを規定する?(口頭発表の部)

    星野 力, 佐藤 努, 近藤 智裕, 酒井 義之, 石橋 英一

    天然有機化合物討論会講演要旨集39 ( 0 ) 145 - 150   1997年

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:天然有機化合物討論会実行委員会  

    There has been remarkable advances in the studies of oxidosqualene and squalene cyclases in the past ten years. First, complete purifications of the enzymes have been attained from several species such as vertebrates, plant, yeast and bacterium, irrespective of unstable and membrane-bound nature. Second, application of cDNA cloning technique to the cyclases have succeeded in determining the alignments of amino acids from various biological sources including human. Third, the substrate analogues including the suicide inhibitors have made a great contribution to the polycyclization mechanism. In this symposium, we report a definitive evidence that the polycyclization proceeds via the discrete carbocationic intermediate formed during the cyclization, but not via a concerted manner as proposed before; substitution of methyls with ethyl groups at 10- and 15-positions 6 halted the enzymic reaction at the monocyclic stage 7 and 8. Substrate analogue 9 with ethyl group at 15-position afforded 10 (normal cyclization) and 11 (tricyclic 6/6/5), the latter being formed under the control of Markovnikov rule. This is in contrast to the protosterol cation, which is formed under anti-Markovnikov control. Thus, oxidosqualene would be converted via the 5-membered intermediate 12 under the control of Markovnikov rule, which then undergoes a ring expansion to form 6-membered C-ring. Mechanisms of the formation of tetrahymanol and hopene from squalene itself are discussed, especially on the terminal cyclization (E-ring formation). Substrate analogs 14, 15, 18, 22 have demonstrated the cyclization mechanisms as follows: for tetrahymanol cyclase, the terminal cyclization proceeds by the process of stereoelectronic control, suggesting little participation of the enzyme, while hopene cyclase strongly binds to the terminal methyl groups to form 5-membered E-ring. From our studies, methyl groups of the substrate seem to bind the cyclase enzymes and the substrates were then subjected to the folding of chair-boat or chair-chair inside the enzymes leading to production of the desired triterpene skeletons. Over-expression of hopene cyclase was achieved successfully and the point mutations of amino acids in QW motif proved that the functions of D and W are crucial for the enzyme activity.

    DOI: 10.24496/tennenyuki.39.0_145

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  • 好熱好酸菌Alicyclobacillus acidocaldarius由来スクアレン-ホペン閉環酵素(SHC)の大腸菌における高発現系の構築 : 有機化学・天然物化学

    佐藤 努, 金井 芳則, 星野 力

    日本農藝化學會誌70 ( 0 ) 241 - 241   1996年3月

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    記述言語:日本語   出版者・発行元:社団法人日本農芸化学会  

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講演・口頭発表等

  • 非天然型オノセロイドの酵素合成

    平井 奈実, 井上真緒, 上田 大次郎, 品田哲郎, 佐藤努

    香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会  2020年10月 

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  • 非末端環化型トリテルペン/セスクアテルペン環化酵素のゲノムマイニング

    寒河江侑加, 井上真緒, 上田大次郎, 佐藤努

    香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会  2020年10月 

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  • 龍涎香人工合成経路の構築:アンブレインと香気成分の効率的合成と破骨細胞分化誘導活性

    山辺 陽太, 川越 幸奈, 奧野琴音, 上田大次郎, 柿原 嘉人, 佐藤努

    2020年3月 

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  • Mycobacterium属細菌由来新型セスクアテルペン環化酵素の高感度活性測定法の構築とそれを利用した探索

    阿部透, 尾崎真夢, 吉田優里, 三浦彩奈, 相良昌寛, 上田大二郎, 金古堅太郎, 三ツ井敏明, 佐藤努

    日本農芸化学会  2019年3月 

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  • スクレイレン‐アンブレイン環化酵素の創出:アンブレインはスクレンレンから二つの経絡を経由して一つの酵素により合成される

    山辺陽太, 奥野琴音, 井上真緒, 上田大次郎, 佐藤努

    日本蛋白質科学会年会プログラム・要旨集  2018年5月23日 

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    記述言語:日本語  

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  • スクアレン‐アンブレイン環化酵素の創出:アンブレインはスクアレンから2つの経路を通して1つの酵素によって合成できる

    上田大次郎, 奥野琴音, 星野力, 佐藤努

    日本生物工学会大会講演要旨集  2017年8月8日 

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    記述言語:日本語  

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  • スクアレン‐アンブレイン環化酵素の創出:アンブレインはスクアレンから一つの酵素によって2つの経路を経て合成できる

    奥野琴音, 上田大次郎, 村上瑞気, 星野力, 佐藤努

    イソプレノイド研究会例会講演要旨集  2016年9月20日 

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    記述言語:日本語  

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  • スクアレンからアンブレインへの一段階酵素合成

    奥野琴音, 上田大次郎, 星野力, 佐藤努

    日本農芸化学会大会講演要旨集(Web)  2016年3月5日 

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    記述言語:日本語  

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  • 龍涎香の主成分アンブレインの酵素合成

    佐藤努

    日本農芸化学会大会講演要旨集(Web)  2016年3月5日 

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    記述言語:日本語  

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  • 3P-269 Bacillus clausiiにおけるセスタテルペン、Head-to-tail型トリテルペン、セスクアテルペンの生合成 : 多機能性酵素の同定とイソプレノイド代謝物の解析(生合成,天然物化学,一般講演)

    上田 大次郎, 山鹿 宏彰, 村上 瑞気, 遠塚 悠輔, 品田 哲郎, 佐藤 努

    日本生物工学会大会講演要旨集  2015年 

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    記述言語:日本語  

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  • 龍涎香の主成分アンブレインの酵素合成

    上田大次郎, 星野力, 佐藤努

    香料・テルペンおよび精油化学に関する討論会講演要旨集  2014年9月20日 

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    記述言語:日本語  

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  • スクアレンの両末端環化:オノセロイド合成酵素の初めての同定および龍涎香主成分ambreinの酵素合成

    上田大次郎, 星野力, 佐藤努

    イソプレノイド研究会例会講演要旨集  2014年9月12日 

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    記述言語:日本語  

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  • スクアレンの両末端環化:オノセロイド合成酵素の初めての同定および龍涎香主成分ambreinの酵素合成

    上田大次郎, 星野力, 佐藤努

    酵素工学研究会講演会講演要旨集  2014年4月26日 

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    記述言語:日本語  

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  • スクアレンの両末端環化:オノセロイド合成酵素の初めての同定および龍涎香主成分ambreinの酵素合成

    上田大次郎, 星野力, 佐藤努

    日本農芸化学会大会講演要旨集(Web)  2014年3月5日 

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    記述言語:日本語  

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  • セスクアテルペン環化酵素を基軸とするテルペン創出経路の開拓

    上田 大次郎, 山鹿 宏彰, 岡本 渉, 遠塚 悠輔, 品田 哲郎, 星野 力, 佐藤 努

    天然有機化合物討論会講演要旨集  2014年 

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    記述言語:日本語  

    <p>はじめに</p><p>我々は、天然物探索から新規C<sub>35</sub>テルペンを発見して以来、C<sub>35</sub>テルペンに着目して研究を行っている<sup>1-6)</sup>。50,000種類を超えるテルペン類の中で、C<sub>35</sub>テルペンには長らく特別な分類名がなかったが、直鎖状C<sub>35</sub>イソプレノイドの環化を経る経路を酵素・遺伝子レベルで初めて証明し、「セスクアテルペン」と命名した<sup>2-5)</sup>。本経路には、1990年代から数多く見出されてきたテルペン環化酵素の一次構造と類似性をもたない「新型」テルペン環化酵素(テトラプレニル-β-クルクメン合成酵素:TS)が関わることを明らかにした(Scheme 1)<sup>2-5)</sup>。また、Bacillus megaterium由来のテトラプレニル-β-クルクメン環化酵素(TC)は、C<sub>35</sub>とC<sub>30</sub>の基質から各々4環と2環を形成する二機能性テルペン環化酵素であることを証明した<sup>2,3,6)</sup>。異なる2種類のテルペンを生体内で生合成する初めてのテルペン環化酵素であった(Scheme 1)<sup>2,3,6)</sup>。</p><p>今回、セスクアテルペン環化酵素であるTSおよびTCに関する研究をさらに展開し、テルペン創出経路を開拓したので報告する。</p><p> </p><p>1)TSホモログのゲノムマイニングによる新規セスタテルペン・新規トリテルペンの発見<sup>7)</sup></p><p>TSホモログは、様々なバクテリアにおいて機能未知遺伝子として存在している。今回、手始めに好アルカリ性のBacillus clausiiのもの(Bcl-TS)をターゲットにした。B. clausiiゲノムにおいてTSホモログが存在するにも関わらず、菌体から化合物1が検出されなかった。一方、テルペン類と考えられる未知脂質(5と6)がGC-MSによって検出されたため、それらを単離・構造決定した。その結果、新規非環状セスタテルペン(5)と新規非環状トリテルペン(6)であることが判明した。各々β-geranylfarneseneおよびβ-hexapreneと命名した。</p><p>B. clausiiゲノムにおいてBcl-TS以外にテルペン合成酵素ホモログが存在しないことから、Bcl-TSが化合物5と6の生合成に寄与していることが考えられた。Bcl-TSの大腸菌発現系を構築後、精製Bcl-TSによってGFPP(C<sub>25</sub>)とHexPP(C<sub>30</sub>)から各々5と6が生成されることをin vitroで証明した(Scheme 2)。</p><p>Table 1に示したように、化合物5と6は多くの好アルカリ性Bacillusに分布していた<sup>7)</sup>。以前、B. alcalophilusのような好アルカリ性Bacillusはスクアレン3やデヒドロスクアレンを生産することが報告されていたが<sup>8)</sup>、我々は化合物5と6が生産されていると訂正した。</p><p> 本研究によって、TSホモログがセスクアテルペン(C<sub>35</sub>)だけでなくC<sub>25</sub>やC<sub>30</sub>のような様々なテルペン合成酵素のファミリーであることが判明した。今後も、TSホモログのゲノムマイニングによって多くの新規テルペンを発見できるのではないかと期待している。</p><p>2)TCによる</p><p>(View PDFfor the rest of the abstract.)</p>

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  • 17 細菌由来のsesquarterpenes(C_<35>テルペン) : ユニークな生合成酵素の同定と新規天然物探索(口頭発表の部)

    佐藤 努, 中島 真美, 星野 力, 星野 紘子, 吉田 悟, 滝沢 和央, 折戸 悠梨子, 高木 亮輔, 丹野 瑞樹, 工藤 はなよ, 小野 恵梨

    天然有機化合物討論会講演要旨集  2011年 

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    記述言語:日本語  

    In this study, mono- and pentacyclic C_<35> terpenes from Bacillus subtilis were biosynthesized via the cyclization of C_<35> isoprenoid by using purified enzymes, including the first identified new terpene cyclase, tetrapreny1-13-curcumene synthase, that shows no sequence homology to any of the known terpene cyclases. Based on these findings, we propose that these C_<35> terpenes are called the new family of "sesquarterpenes." This study demonstrated that a tetrapreny1-β-curcumene cyclase (TC) from B. subtilis, which was originally identified as a sesquarterpene cyclase converting a head-to-tail type of monocycle to a pentacycle, also cyclized a tail-to-tail type of linear squalene into a bicyclic triterpenol, 8α-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene. The 8α-Hydroxypolypoda-13,17,21-triene was found to be a natural triterpene from B. megaterium, suggesting that the TC is bifunctional, cyclizing both tetrapreny1-α-curcumene and squalene in vivo. This is the first report describing the bifunctional terpene cyclase, which biosynthesizes 2 classes of cyclic terpenes with different numbers of carbons as natural products in the organism. Non-pathogenic Mycobacterium species also produce cyclic sesquarterpenes, which are biosynthesized via cyclization of Z-type C_<35> polyprenyl diphosphate. To provide deeper insight into the biosynthesis of sesquarterpenes, we carried out functional analyses of three Z-prenyltransferase homologues in M vanbaalenii identified by genomic analysis. Mvan_3822, a novel bi-functional Z-prenyltransferase, biosynthesizes C_<35>-heptaprenyl diphosphate as a main product from E,E-FPP and E,E,E-GGPP, but produces a C_<50>-decaprenyl diphosphate from GPP. Mvan_1705 is a novel Z,E,E-GGPP synthase. In addition, novel cyclic C_<35>-terpenes, 14E- and 14Z-dehydroheptaprenylcycline, were identified as minor metabolites in non-pathogenic Mycobacterium cells. Sesquarterpenes could be biosynthesized by two routes, in which E- and Z-geometric isomers of heptaprenyl diphosphate are produced from E,E-FPP and E,E,E-GGPP, and the prenylreductase responsible for the biosynthesis of sesquarterpenes may work to reduce both E- and Z-prenyl residues. The studies on sesquarterpenes promise to be an attractive field for expanding our understanding of the terpene world.

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  • P-85 非病原性Mycobacterium属細菌から得られた新規環状C_<35>テルペンのZ型C_<35>ポリプレニル二リン酸の環化反応による生合成(ポスター発表の部)

    佐藤 努, 木川 敦史, 高木 亮輔, 足立 知美, 星野 力

    天然有機化合物討論会講演要旨集  2008年 

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    記述言語:日本語  

    Lipid components from 12 nonpathogenic Mycobacterium species were analysed. A novel cyclic C_<35>-terpene, named heptaprenylcycline 1, was obtained from 3 species, while octahydroheptaprenol 2, which has 3 Z-double bonds, was obtained from 6 species. The amounts of 1 and 2 in the cultured cells increased after the 4- to 6-d stationary phase. The yield of 1 was considerably greater at a higher temperature of 37℃ than at an optimal growth temperature of 28℃, while that of 2 remained unchanged at all the temperatures (20-40℃). A feeding experiment with D-[1-^<13>C] glucose revealed that 1 was produced via isopentenyl diphosphate, which is a metabolite of glycolysis and the methylerythritol phosphate pathway. The conversion of octahydroheptaprenyl diphosphate 2-PP to 1 was successful by using the cell-free extracts of M. chlorophenolicum, demonstrating that 2-PP is the biosynthetic intermediate of 1. This is the first example of the biosynthesis of a natural terpene via the cyclisation of a linear C_<35>-isoprenoid. The substrate 2-PP has Z-type prenyl moieties; however, terpene cyclases usually employ E-type isoprenoids. The gene encoding the terpene cyclase that cyclises prenyl diphosphate containing Z-double bonds has not been reported hitherto. Despite a careful search using the FASTA3 program, we could not detect any gene homologous to the known diphosphate-triggered type of mono-, sesqui- and diterpene cyclases in the genome of M. vanbaalenii, the DNA sequence of which has recently been elucidated. This suggests that a novel type of terpene cyclase might exist in the nonpathogenic Mycobacterium species.

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産業財産権

受賞

  • 第16回酵素応用シンポジウム研究奨励賞

    2015年6月  

    佐藤 努

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  • 農芸化学奨励賞

    2012年3月  

    佐藤 努

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  • Biosci. Biotechnol. Biochem.論文賞

    2002年3月  

    佐藤 努

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共同研究・競争的資金等の研究

  • 活性酸素の非酵素反応が関与するテルペノイド系天然物生合成

    研究課題/領域番号:19K22273  2019年06月 - 2022年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 挑戦的研究(萌芽)  挑戦的研究(萌芽)

    佐藤 努, 岡田 正康, 須原 義智, 廣田 佳久

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    配分額:6500000円 ( 直接経費:5000000円 、 間接経費:1500000円 )

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  • 運動療法がストレス誘発性の顎顔面痛を軽減する脳メカニズム

    研究課題/領域番号:19K10353  2019年04月 - 2022年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    岡本 圭一郎, 黒瀬 雅之, 柿原 嘉人, 佐藤 努, 高木 律男, 山村 健介

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    配分額:4290000円 ( 直接経費:3300000円 、 間接経費:990000円 )

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  • 対称分子から非対称環状骨格へのトリテルペン生合成マシナリーの解析とリデザイン

    研究課題/領域番号:19H04648  2019年04月 - 2021年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)  新学術領域研究(研究領域提案型)

    佐藤 努

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    配分額:7540000円 ( 直接経費:5800000円 、 間接経費:1740000円 )

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  • 新型テルペン環化経路の発見を軸にした多様な未発見テルペン化合物群の開拓

    研究課題/領域番号:18H02145  2018年04月 - 2021年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(B)  基盤研究(B)

    佐藤 努, 藤橋 雅宏

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    配分額:17680000円 ( 直接経費:13600000円 、 間接経費:4080000円 )

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  • 既知イソペンテニル二リン酸異性化酵素ホモログが関与しない生合成経路の解明と利用

    研究課題/領域番号:16K14911  2016年04月 - 2019年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 挑戦的萌芽研究  挑戦的萌芽研究

    佐藤 努, 葛山 智久, 梅野 太輔

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    配分額:3640000円 ( 直接経費:2800000円 、 間接経費:840000円 )

    ファルネシル二リン酸合成酵素がイソペンテニル二リン酸のみを基質としてファルネシル二リン酸を合成した。この結果は、ファルネシル二リン酸合成酵素がイソペンテニル二リン酸異性化酵素活性を持つことを示唆していた。つまり、二機能性のイソペンテニル二リン酸異性化酵素/ファルネシル二リン酸合成酵素を初めて見出すことができた。現在、触媒機構の解明を目指した研究を行っている。

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  • セスクアテルペン生合成酵素を基軸とする新規テルペノイド類創出系路の開拓

    研究課題/領域番号:25450149  2013年04月 - 2016年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    佐藤 努, 藤橋 雅宏, 品田 哲郎

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    配分額:5200000円 ( 直接経費:4000000円 、 間接経費:1200000円 )

    ゲノムマイニングおよび基質許容性解析・多機能性解析から新規テルペンの発見や非天然型テルペンの創出を達成することができた。特に、オノセロイド(スクアレンの両末端環化によって生合成されるトリテルペン)合成酵素を初めて見いだすことができた。加えて、香料や媚薬として利用される龍涎香の主成分アンブレインの酵素合成に成功した。マイコバクテリア由来の新型酵素の発掘や新規酵素の触媒機構解析も順調に進んだ。

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  • 新規酵素群の探索を軸とするイソプレノイド分子多様性の拡充

    研究課題/領域番号:25108709  2013年04月 - 2015年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)  新学術領域研究(研究領域提案型)

    佐藤 努

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    配分額:7020000円 ( 直接経費:5400000円 、 間接経費:1620000円 )

    前年度、Bacillus属細菌からファルネシルファルネシルアセトンを天然物として初めて発見した。本年度、新型酵素の可能性があるファルネシルファルネシルアセトン合成酵素を探索する手始めとして、Bacillus属細菌の無細胞抽出液を用いて想定基質のメナキノンー7と様々な条件で反応実験を行ったが、ファルネシルファルネシルアセトン生成活性を見いだすことができなかった。一方、活性酸素による非酵素的反応によって特異的にメナキノンー7から生産されることをin vitro実験で明らかになった。天然物として知られる他のポリプレニルアセトンも同様の機構によって生合成されている可能性があると考えている。

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  • 珍しい特徴を有する二つの酵素の立体構造に基づく触媒機構解明とその利用

    研究課題/領域番号:24570130  2012年04月 - 2015年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 基盤研究(C)  基盤研究(C)

    藤橋 雅宏, 佐藤 努, 石田 豊和

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    配分額:5460000円 ( 直接経費:4200000円 、 間接経費:1260000円 )

    本研究では2種の酵素の構造と機能の関係を解明し利用することを目指した。第一の酵素ODCaseについては、生成物ウリジン一リン酸との複合体構造(1.03Å分解能)をはじめ、約10種類の結晶構造を決定した。分解能1.03Åは、これまでに解析された200個以上のODCase構造の中で群を抜いて高い。得た構造と生化学的な解析および計算科学的手法を組み合わせ、ODCaseの触媒反応における遷移状態自由エネルギー低下の10-15%は、基質の歪みに由来することを見いだした。もう一つの酵素Cyc2については、アミノ酸配列及び機能が類似した別酵素を対象に、精製及び結晶化に取り組んでいる

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  • メタゲノム由来モジュールライブラリーを用いた非天然型ペプチドの創出

    研究課題/領域番号:23108530  2011年04月 - 2013年03月

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 新学術領域研究(研究領域提案型)  新学術領域研究(研究領域提案型)

    佐藤 努

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    配分額:3510000円 ( 直接経費:2700000円 、 間接経費:810000円 )

    チコリンの生合成に寄与する22個のモジュールからなる非リボソーム型ペプチド合成酵素の全塩基配列(約73 kb)を決定できた。ゲノム内に非常に類似した配列が多数存在することから、紆余曲折があったが、次世代シーケンサー解析、BACクローニング、PCR等によって達成することができた。チコリンの構成アミノ酸のDLは一部決定できていなかったが、Cドメインの配列情報から、立体化学を予想することができた。現在、チコリン生合成遺伝子の大腸菌への導入を試みている。
    チコリン生合成遺伝子の全長配列決定に手間取っていたため、枯草菌由来のサーファクチン生合成も新たにターゲットに加えた。枯草菌でモジュール置換NRPSライブラリーを作るため、サーファクチンの2番目のモジュール遺伝子を破壊した枯草菌の作製や、導入するプラスミドの構築を達成した。したがって、枯草菌由来サーファクチン生合成遺伝子発現系を構築できた。
    汚泥、温泉、水田、堆肥などの土壌から抽出したメタゲノムを鋳型として、数種の組み合わせの保存アミノ酸配列の縮重プライマーを用いてPCRした。ある組み合わせにおいてNRPSと推定されるサイズのバンドが確認できた。プラスミドに導入後、数個のクローンのDNA配列を確認したところ、ほとんどがNRPS遺伝子であり、かつ配列には多様性があることを確認できた。現在、メタゲノムからモジュールライブラリーを作製し、枯草菌由来サーファクチン生合成遺伝子発現系に導入し、非天然型ペプチドの創出を行っている。

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  • 新規C35テルペン環化酵素の発掘からゲノムマイニング及び非天然型創製への展開

    研究課題/領域番号:23780114  2011年 - 2012年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 若手研究(B)  若手研究(B)

    佐藤 努

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    配分額:4550000円 ( 直接経費:3500000円 、 間接経費:1050000円 )

    枯草菌に存在する新型テルペン環化酵素を発見し、C35テルペンに新しい分類名「セスクアテルペン」を命名した。その後、Bacillusclausiiに存在するホモログをゲノムマイニングし、新規非環状セスタテルペン/トリテルペン合成酵素を同定できた。Bacillusmegateriumから二種類のテルペンを生体内で環化する初めての二機能性テルペン環化酵素も同定した。また、マイコバクテリア由来新規セスクアテルペンを単離や、非天然型テルペンの創製も行った。

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  • 細菌の生産するC35テルペンの新型環化酵素の発掘および生理機能・生物活性の解析

    研究課題/領域番号:21780109  2009年 - 2010年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 若手研究(B)  若手研究(B)

    佐藤 努

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    配分額:4550000円 ( 直接経費:3500000円 、 間接経費:1050000円 )

    マイコバクテリアの研究から、E型アリル基質によってC_<35>とC_<50>の生成物を作り分ける二機能性Z型プレニル鎖伸長酵素を初めて発見した。また、2種類の新規C_<35>テルペンを見出すことができ、その構造からEとZの両プレニル基を還元する酵素の存在が示唆された。一方、枯草菌の研究から、新型テルペン環化酵素と5環性C_<35>テルペン環化酵素をin vitro酵素反応によって同定した。

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  • マイコバクテリアの生産する新規C35環状テルペノイドの探索と生合成研究

    研究課題/領域番号:19780085  2007年 - 2008年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 若手研究(B)  若手研究(B)

    佐藤 努

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    配分額:3750000円 ( 直接経費:3300000円 、 間接経費:450000円 )

    2つの新規環状C35テルペンを発見した。また、環状C35 テルペンが直鎖状C35イソプレノイドの環化によって生合成されることを証明した。そのような証明が成されている天然物は他に例がない。M. chlorophenolicum とM. vanbaalenii から合計5種類のZ型プレニル鎖延長酵素遺伝子を見出した。M. vanbaalenii 由来の2種類は機能解析でき、各々主にC35 とC15 を生産することが判明した。

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  • 潜在する微生物テルペノイドの発掘及び新型テルペン環化酵素遺伝子の取得

    研究課題/領域番号:17780088  2005年 - 2006年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 若手研究(B)  若手研究(B)

    佐藤 努

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    配分額:3600000円 ( 直接経費:3600000円 )

    生合成研究:Mycobacterium chlorophenolicumから単離されたC_<35>環状テルペンはZ型のC_<35>直鎖状ポリプレニルニリン酸の環化反応によって生合成されると予想している。それを支持する証拠を得るため、市販の安価な試薬から容易に合成できる短鎖のC_<10>とC_<15>のポリプレニルニリン酸を基質として用いて無細胞抽出液と反応させた。E型のC_<10>ポリプレニルニリン酸は反応しなかったのに対し、Z型はC_<35>環状テルペンの部分構造と類似したリモネンを生成した。また、ω.E.E体のC_<15>のポリプレニルニリン酸も反応せず、ω, Z, Zで体は環化反応した。これらの結果は、Z型のポリプレニルニリン酸にのみ基質特異性をもつテルペン環化酵素が存在することを示していた。現在知られているテルペン環化酵素はE型を天然基質とするものだけであることから、新規性の高いテルペン環化酵素が存在していることが示唆された。
    遺伝子クローニング:昨年度までに2つのZ型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の一部を縮重プライマーによってクローニングしていた。今年度、染色体歩行によって上・下流の塩基配列を読み進んだ。高いGC含量の影響等により容易に読める配列ではなかったが、様々なシーケンス反応の条件を検討し改良した結果、Z型プレニルトランスフェラーゼ遺伝子の全長を読むことができた.現在、更に上・下流を読むことによってC_<35>環状テルペン生合成酵素の候補遺伝子を探している.また、2つのZ型プレニルトランスフェラーゼの生成物を同定するため、pET系ベクターで発現させる実験を進行した。

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  • 新規テルペン環化酵素の微生物ゲノムからの発掘

    研究課題/領域番号:15780083  2003年 - 2004年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 若手研究(B)  若手研究(B)

    佐藤 努

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    配分額:3600000円 ( 直接経費:3600000円 )

    本研究では、ゲノム解析から見出された推定のテルペン環化酵素の機能解析を行い、新規環状骨格を形成する環化酵素の発見につなげることを目的としている。
    本年度において、すでにクローニングと大腸菌における発現を達成している結核菌Mycobacterium tuberculosis由来の推定環化酵素について研究を進めた。基質はゲラニルゲラニル2リン酸であることが判明していたが、生成物の構造は確定していなかった。そこで、単離・精製し、MS及びNMRによって構造解析したところ、今までに見出されていないハリマン骨格のジテルペン(二リン酸体)であることが解った。
    他のミコバクテリア属にも新規テルペンが存在するのではないかと予想し、Mycobacterium smegmatisの炭化水素成分のGC-MS分析を行ってみた。その結果、新規物質の可能性がある2種類の脂質を見出すことができた。大量培養後、各種クロマトグラフィーによって単離・精製した。MS及びNMRによって構造解析したところ、両者ともC_<35>の単環性の炭化水素であることが判明した。構造からヘプタプレニル二リン酸の二リン酸脱離から開始する環化反応によって生合成されることが推測される。我々の知る限り、このようなC_<35>テルペン類の報告はなく、天然物として初めての例ではないかと考えている。
    スクアレン環化酵素の研究も同時に進めた。変異型酵素を機能解析し、反応最終段階の脱プロトン化の触媒機構について新たな知見を得ることができた。また、原核生物のスクアレン環化酵素を真核生物由来トリテルペン環化酵素型(Gly600欠損型酵素)の基質特異性へ改変することに成功した。

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  • スクアレン環化酵素の触媒反応機構の分子生物学的手法による解明

    研究課題/領域番号:00J05448  2000年 - 2001年

    日本学術振興会  科学研究費助成事業 特別研究員奨励費  特別研究員奨励費

    佐藤 努

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    配分額:2400000円 ( 直接経費:2400000円 )

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